Name: evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice
Uploaded: 2013-02-09T14:00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (AR-49.419, DD), Muskelsvindfonden Association (DD), og NIH træning tilskud T90DK70105 (CH).

1. Evaluering af det kontraktile og Passiv Egenskaber af EDL muskel Ex vivo De kontraktile og passive egenskaber af EDL muskler måles ex vivo ved hjælp af Aurora Scientific in vitro muskel testsystem. Se Tabel 1 for materialer og udstyr. 1.1 Udstyr præparat <ol><li> Saml vævs-organbadet ved at fastgøre oxytube til vand-kappe vævsbad. Fastgør den samlede bad til musklen montage apparat. Slut gasledningen til oxytube. Fastgøre vandcirkulation linier til vand-kappe vævsbad og placere nåleventilen i badet dræning. </li><li> Tænd for cirkulerende vandbad og justere temperaturen til 30 ° C 7. Tillad 5 PSI (pounds per square inch) af 95% O2 -5% CO2 at strømme gennem oxytube. Fyld badekarret med Ringers puffer. Ækvilibrere puffer i mindst10 min med en konstant gasstrøm ved at justere oxytube ventilen. </li><li> Tænd instrumenterne (stimulator, dual-mode løftestang system, og signal-interface). Læg den dynamiske muskel kontrol (DMC) software i henhold til producentens anvisninger. </li></ol> 1,2 EDL muskel dissektion Alle dyreforsøg skal godkendes af The Institutional Animal Care og Use Udvalg. <ol><li> Bedøve mus med intraperitoneal injektion af 2,5 gl / g legemsvægt af den anæstetiske cocktail (se materialer afsnit). Under hele den kirurgiske procedure, blev dybden af ​​sedation kontrolleret ved at udføre en tå pinch. Et supplement af 10% af den oprindelige anæstetiske dosis administreres efter behov for at holde dyret under anæstesi. Barbering bagbenet. Opretholde kroppens temperatur ved 37 ° C før dissektion procedure ved at anbringe musen på en varmepude. Kropstemperaturen overvåges ved konstant måling af rektal temperature hjælp af en termisk sonde. </li><li> Anbring musen liggende på dissektion bord (figur 1). Træk benet huden for at blotlægge bagbenet muskler. Fastgøre ben på Sylgard blokken under anvendelse af to dameskrædder stifter, en i foden og den anden i gracilismusklen. Anbring en varmelampe over musen, at opretholde kroppens kernetemperatur ved 37 ° C. Konstant superfuse alle udsatte muskler med Ringers buffer. Dræne overskydende puffer via en vakuumledning. </li><li> Udsætte distale TA senen og extensor ligament under et stereomikroskop ved at dissekere huden mod foden. Tag forsigtigt fascia dækker TA muskel. Skær extensor ligament at frigive den distale TA senen. </li><li> Skær den distale TA senen og bruge den til at skrælle TA musklen. Fjern forsigtigt TA muskel ved sin proximale vedhæftet fil. Placere et tyndt stykke Ringers puffer gennemvædet bomuld siden af ​​EDL muskler til at absorbere blødning forårsaget af brud af TA musklen vaskulatur. Brug vakuumledning til fjernelse af overskydende puffer og blod. </li><li> Binde en dobbelt kvadrat knob efterfulgt af en sløjfe knude med et brød silkesutur på musklen senen junction (MTJ) af den distale EDL muskler (figur 2). Lave et snit i den distale del af biceps femoris-musklen for at blotlægge den proximale EDL muskler. Gentag den samme sæt knob (fig. 2) ved MTJ af den proximale EDL senen. Fastgør vippearmen krog til enten den proximale eller den distale knuder med en dobbelt knude anvendelse af den samme sutur linje. Skær den resterende sutur linje. </li><li> Skær den proximale EDL senen overlegen i forhold til den proximale sutur knude. Løft EDL muskel med krogen og skære karrene under musklen. Skær den distale EDL senen ringere end den distale sutur knude for at fjerne EDL muskler fra bagbenet. Dækker den blotlagte bagbenet med et stykke Ringers puffer gennemvædet bomuld. </li><li> Fastgør krogen til vægtstangsarmen. Juster musklen lodretmellem to elektroder. Fastgør den distale sutur linie til den faste stilling. Løft vævsbadet til nedsænkning af musklen i Ringers puffer. Juster hvilespænding på 1,0 g hjælp af den dobbelte grove / fine translationstrinnet og lade musklen at ækvilibrere i mindst 10 min. </li></ol> 1,3 Måling af kontraktile og passive egenskaber af EDL muskler Brug Tabel 2 for at indstille de parametre i DMC software for hver af de følgende målinger. Analyser data ved hjælp af dynamiske muskel analyse (DMA) software. 1.3.1 Måling de kontraktile egenskaber EDL muskler <ol><li> Stimulering af EDL muskler tre gange ved 150 Hz med 60 sek hinanden for at stabilisere musklen 8. </li><li> Stimulering af EDL muskler ved forskellige hvilesteder spændinger til at bestemme den optimale længde (Lo). Den optimale længde er længden på hvilken muskel udvikler maksimal twitch spænding. Lade musklen tilslappe af i 2 min. </li><li> Juster hvilespænding til Lo. Mål muskelkraft ved enkelt twitch stimulation. Bestemme den absolutte twitch kraft (Pt), tid til maksimal spænding (TPT) og halvdelen relaksationstid (½ RT) af Pt. Lad musklen til at slappe af i 2 min. </li><li> Juster hvilespænding til Lo. Måle tetanisk muskelkraft genereret ved forskellige stimulation frekvenser (50, 80, 100, 120, 150 og 200 Hz). Bestem den absolutte maksimale tetanic muskelkraft (Po), hvor muskelkraft når maksimal. Mål TPT og ½ RT for Po 9. </li><li> Lad musklen til at slappe af i 5 min. Juster hvilespænding til Lo. Påfør 10 cykler af excentriske kontraktioner med 2 min hvile mellem cykler. Beregn den relative kraft tab af Po efter hver cyklus af excentrisk kontraktion. </li><li> Tag EDL muskel fra apparatet, og skære senerne på suturen site. Bestem musklen vådvægt og beregne muskel tværsnitsareal (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Måling af passive egenskaber af EDL muskel <ol><li> Dissekere den kontralaterale EDL muskler og fastgør den til apparatet som beskrevet i afsnit 1,2, trin 2 til 7. </li><li> Emne EDL muskler til en seks-trins strækning protokol hvor musklen er anstrengt til 160% Lo med en stigning på 10% Lo. Analyser stress-strain profil 6. </li><li> Evaluere den viskose egenskab ved EDL muskler ved at måle stress relaktionsrate (SRR) ved følgende tidsrammer efter strækning og holde musklen ved 10% Lo: fra top til 0,1 s post-peak (pp), fra 0,1 til 0.2S pp, fra 0,2 til 0,5 s procentpoint, fra 0,5 til 1s pp og fra 1 til 1.5s pp. </li><li> Ved afslutningen af ​​studiet, aflive mus ved cervical dislokation og / eller dekapitation mens musen er stadig under anæstesi. Tag EDL muskel fra apparatet, og skære senerne på suturen site. Bestem muskel våd vægt og beregne muskel korset sectional område (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluering af de kontraktile egenskaber af TA Muscle In situ De kontraktile egenskaber TA musklen måles ved hjælp af Aurora Scientific in situ muskel testsystem. Se Tabel 1 for materialer og udstyr. 2,1 Udstyr forberedelse <ol><li> Opvarmning af termo-kontrollerede dyr fase til 37 ° C ved hjælp af cirkulerende vand-bad. </li><li> Tænd instrumenterne (stimulator, dual-mode løftestang system, og signal-interface). Indlæs DMC software i henhold til producentens anvisninger. </li></ol> 2,2 Fremstilling af TA muskel til in situ kraftmaalingen <ol><li> Anesthetize musen, barbere bagbenet og udsætte TA muskel som beskrevet i trin 1 til 3 i afsnit 1,2. </li><li> Bind en dobbelt knude omkring knæskallen ligament USIng a brød silkesutur. Binde en dobbelt knude efterfulgt af en sløjfe knude på MTJ af den distale TA musklen (figur 2), binde anden dobbelt knude forlader en ~ 10 mm sløjfe fra den distale TA senen knude anvendelse af den samme sutur linje. Anbring den anden dobbelt knude på den side af sløjfen. </li><li> Fjern benene fra bagbenet og placere dyret udsat. Udsætte biceps femoris-musklen. Foretage et indsnit i midterlinjen at afsløre iskiasnerven. Binde en dobbelt knude rundt om den proximale ende af iskiasnerven. Trimme den ene side af suturen linjer og skæres nerven overlegen i forhold til knuden. Forsigtigt, træk iskiasnerven mod knæet ved hjælp af suturen linje og fjerne det omgivende bindevæv til fri ~ 5 mm af dens længde. Du må ikke strække nerven i løbet af denne procedure og konstant superfuse nerven med ringetonen buffer. </li><li> Forbered den kontralaterale TA muskel som beskrevet i trin 1 til 3. Omfatte en af ​​de eksponerede bagbenet med et stykke Ringer buffer gennemvædet bomuld. Konstant superfuse begge bagben med foropvarmet (37 ° C) Ringers puffer. Fjern overskydende puffer via en vakuumledning. </li><li> Placer dyret liggende på dyret platform. Sæt knæet klemme holder til dyret platform og sikre begge knæ til metal pin med dobbelte kantede knob ved hjælp af patella ligament sutur linjer. Pin begge fødder på Sylgard blokken ved hjælp dameskrædder ben. Fastgør dyret platform på termo-kontrollerede fase. Placer varmelampe for at opretholde dyrets kroppens kernetemperatur ved 37 ° C. </li><li> Fastgør elektrodeholderen til dyret platform og lægge iskiasnerven på elektroden ved hjælp af suturen linje. Holde elektroden væk fra bagbenet muskler. Skær den distale TA senen af ​​den udækkede bagben på MTJ suturstedet. Vedhæfte den distale TA senen sutur sløjfe til vægtstangsarmen krogen. Dække den eksponerede bagbenet musklen med en varm Ringers puffer gennemvædet bomuld. </li></ol><ol><li> Brug Tabel 2 for at indstille parametrene i DMC-softwaren. Følge den samme protokol som beskrevet i afsnit 1.3.1 til at bestemme de kontraktile egenskaber TA musklen. Analyser data ved hjælp af DMA-software. </li><li> Efter kontraktile ejendom måling frigøre den distale TA senen sutur loop fra broen arm krog. Fjern TA musklen. Bestem muskel vådvægt og beregn CSA 10. </li><li> Måle de kontraktile egenskaber af den kontralaterale TA muskel ifølge trin 1 til 3 beskrevet ovenfor. Aflive musen efter fastlagte retningslinier ved slutningen af ​​undersøgelsen. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

I denne protokol, har vi illustreret fysiologiske assays til måling af kontraktile og passive egenskaber EDL muskler og de kontraktile egenskaber TA musklen. Et stort problem i muskelfysiologi studier er iltning af målet muskel. For store muskler (såsom TA muskel), er in situ fremgangsmåde foretrækkes, fordi oxygendiffusion fra Ringers puffer ikke kan nå midten af musklen i et in vitro assay. In situ metode ikke forstyrrer normal blodforsyning og hypoksi-associeret kunstige effekter undgås. EDL muskel er en af ​​de mest almindeligt anvendte muskel i fysiologi undersøgelse. Tilstrækkelig iltning af hele musklen kan opnås i et in vitro-system på grund af den lille størrelse af musklen. Yderligere er in vitro-system tilvejebringer et lukket miljø at manipulere koncentrationen af ioner (Ca 2 +, Na + og K +) og Chemikalier (ATP og glucose), der er nødvendige for optimal muskelkraft generation. Dette giver en stor mulighed for at undersøge virkningen af ​​disse variabler på magt produktion. Nøjagtig måling af de kontraktile og passive egenskaber af led musklen er kritisk at undersøge skeletalmuskelfunktion. Karakteristiske ændringer af disse egenskaber er ofte betragtes som kendetegnende for forskellige muskelsygdomme. Ændringer i disse parametre er også vigtige indikatorer for at afgøre, om en eksperimentel behandling er effektiv eller ej.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Producent </td><td></td><td> Specifikationer og kommentarer </td></tr><tr><td> Tissue-organbad </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Vand-jacket vævsbad (Cat # 158351-LL), Oxygen disperser rør (Cat # 160192), Luer ventil (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Cirkulerende vandbad </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gasblanding </td><td> Airgas National, Charlotte, NC, USA </td><td></td><td> 95% O2 og 5% CO2 </td></tr><tr><td> In vitro muskelfunktion analyseindretningen </td><td> Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Systemet består af en stimulator (Model # 701A), en dual-mode stangsystemet (Model # 300C eller 305C), et signal-interface (Model # 604B) og en test apparatus (Model # 800A) til lodret montere væv organbad </td></tr><tr><td> In vitro muskelfunktion assay software </td><td></td><td></td><td> Dynamisk muskel kontrol (DMC) software og dynamisk muskel kontrol dataanalyse (DMA) software </td></tr><tr><td> Mus anæstesi cocktail blandet i 0,9% NaCI </td><td> Der henvises til de institutionelle retningslinjer </td><td></td><td> Ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) og acepromazin (0,5 mg / ml). Hele den kirurgiske procedure, kan et tillæg på 10% af den oprindelige dosis nødvendig for at holde dyr under bedøvelse. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Verden Precision Instrument </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> En skræddersyet Plexiglas dissektion board </td><td> I designet hus </td><td></td><td> Der henvises til figur 1 </td></tr><tr><td> Varmelampe </td><td> Tensor Lighting Company,Boston, MA, USA </td><td></td><td> 15 Watt lampe at holde musen varm under dissektion </td></tr><tr><td> Ringers Buffer </td><td> Kemikalier indkøbt fra Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td> Sammensætning i mM: 1.2 NaH 2 PO4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCI (Cat # 217), 24 NaHCO3 (Cat # S233), 2 CaCl2 (Cat # C79) og 10 glucose (Cat # D16). Opløs kemikalier enkeltvis og blandes i ovenstående rækkefølge. Opbevares ved 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stereo dissektionsmikroskop </td><td> Nikon, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsværktøj </td><td> Fin Science Tools, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Grov pincet, grove sakse, fine pincet (Lige og 45 ° vinkel) </td></tr><tr><td> Flettet silkesutur # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Suturer, Norwalk, CT, USA </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> En skræddersyet rustfrit stål krog </td><td> Små Parts, Inc. </td><td></td><td> 2&#39;&#39; lange S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) for krafttransducer 305C eller 2,5&#39;&#39; lange S / S 304V (0,012&#39;&#39; diameter) for transduceren 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> In situ muskelfunktion assaysystem </td><td> Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Systemet (809B, in situ mus apparat) består af en stimulator (Model # 701B), en dual-mode stangsystemet (Model # 305C), et signal-interface (Model # 604A) og thermo styret fodplade apparat (Model # 809A ) </td></tr><tr><td> In vitro muskelfunktion assay software </td><td> Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Dynamisk muskel kontrol (DMC) software og dynamisk muskel kontrol dataanalyse (DMA) software </td></tr><tr><td> En skræddersyet TA assay dyr platform </td><td> I designet hus </td><td></td><td> Henvises til figur 2 </td></tr><tr><td> En skræddersyet rustfrit stål krog </td><td> Små Parts, Inc. </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; lange S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) </td></tr><tr><td> Custom-made 25G platinelektroder </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> Lod to 0,016&#39;&#39; tykke platin ledninger til to 24G elektriske ledninger </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Materialer og udstyr.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Kropsbevægelser er hovedsageligt af mekanisk funktion af skeletmuskulatur. Skeletmuskel er sammensat af mange bundter af myofibre, som er omviklet med intramuskulære bindevæv. Hver myofiber indeholder mange myofibriller, der løber i længderetningen langs længden af ​​myofiber. Myofibriller er det kontraktile apparat af muskler, og de er sammensat af gentagne kontraktile enheder kaldet sarkomerer. En sarkomer enhed indeholder actin og myosin filamenter, der er fordelt som Z skiver og titin protein. Mekaniske funktion af skeletmuskel er defineret af de kontraktile og passive egenskaber af musklen. De kontraktile egenskaber anvendes til at karakterisere mængden af ​​kraft, der frembringes under muskelsammentrækning, når styrkeopbygningsproces og tidspunkt for muskelafslapning. Enhver faktor, der påvirker muskelkontraktion (f.eks interaktion mellem actin og myosin filamenter, homeostase af calcium, ATP / ADP-forhold osv.) påvirker den kontraktile properties. De passive egenskaber henviser til de elastiske og viskøse egenskaber (stivhed og viskositet) af musklen i fravær af kontraktion. Disse egenskaber bestemmes ved den ekstracellulære og intracellulære strukturelle komponenter (såsom titin) og bindevæv (primært collagen) 1-2. De kontraktile og passive egenskaber er to uadskillelige aspekter af muskelfunktion. For eksempel er albue fleksion opnået ved sammentrækning af muskler i den forreste rum af overarmen og passiv strækning af musklerne i det posteriore kammer på overarmen. For virkelig at forstå muskelfunktionen, bør begge kontraktile og passive egenskaber undersøges. En sammentrækning og / eller passive mekaniske egenskaber af muskel er ofte kompromitteret i muskelsygdomme. Et godt eksempel er Duchennes muskeldystrofi (DMD), en alvorlig muskelsvind sygdom forårsaget af dystrophin deficiency 3. Dystrofin er et cytoskelet-proteidet stabiliserer musklen cellemembranen (sarcolemma) under muskelsammentrækning 4. I fravær af dystrofin er sarcolemma beskadiget af forskydningskraft dannet under kraftoverføring. Denne membran rive initierer en kædereaktion, der fører til muskel celledød og tab af kontraktile maskiner. Som følge heraf er muskelkraft reduceres og døde myofibre erstattes af fibrotiske væv 5. Denne senere ændring øger muskelstivhed 6. Nøjagtig måling af disse ændringer tilvejebringer vigtig rettesnor at evaluere sygdommen og til at bestemme den terapeutiske virkning af hidtil ukendt gen / celle / farmakologiske indgreb. Her præsenteres to metoder til at evaluere både kontraktile og passive mekaniske egenskaber af extensor digitorum longus (EDL) muskel og de kontraktile egenskaber tibialis anterior (TA) muskel.

De følgende resultater er en repræsentation fra vores tidligere rapporter 6,9. Data præsenteres som gennemsnit ± standardfejl af middelværdien. Tabel 3 viser de morfometriske egenskaber EDL muskler i normal BL10 og dystrophin-deficient (mdx) mus på 4-6 måneder. Figur 4 viser repræsentative kontraktile og passive egenskaber EDL muskel fra BL10 og MDX mus. De kontraktile egenskaber EDL muskel er beskrevet af de følgende betingelser, herunder den specifikke (absolut kraft divideret med CSA) twitch kraft (figur 4A), specifik maksimal tetanisk kraft (figur 4B), TPT og ½ RT for den absolutte maksimale tetanisk force (figur 4C og D). The TPT og ½ RT kan også beregne den absolutte twitch kraft. Stress-strain profil (Figur 4E), og SRR (fig. 4F) enre anvendes til at beskrive de passive egenskaber af EDL muskler. Fravær af dystrofin har en betydelig indvirkning på de kontraktile og passive egenskaber af EDL muskel 6,9. Specifik spjæt og tetaniske kræfter er betydeligt reduceret i MDX EDL muskel. Det TPT er betydeligt hurtigere, mens ½ RT er betydeligt langsommere i MDX EDL muskel. Stress-strain profilen antyder, at stivhed er signifikant forøget i MDX EDL muskel. MDX EDL muskel giver også et betydeligt meget højere modstand kraft (passiv stress), før de når peak stress, mens de post-peak spændinger falder meget hurtigere. Endvidere SRR var signifikant højere i mdx EDL muskler sammenlignet med den BL10 EDL muskler. Statistisk analyse Statistisk signifikans mellem to grupper analyseres af Student t-test. For sTATISTISK betydning blandt flere grupper, One-way eller Tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc analyse anbefales at bruge SAS software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Forskellen anses for signifikant, når p &lt;0,05. Tabel 1. Materialer og udstyr. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Eksperiment </td><td class="jove_content_small"> Hvilespænding (gram) </td><td class="jove_content_small"> Pulse frekvens (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Impulsbredde (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stimulation varighed (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch længde </td><td class="jove_content_small"> Stretch varighed (ms) </td><td class="jove_content_small"> Strækningshastighed </td><td class="jove_content_small"> Kommentarer </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. Evaluering af kontraktile og passive egenskaber af EDL muskel ex vivo </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Måling de kontraktile egenskaber EDL muskler </td></tr><tr><td> 1. Varm op </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Hvil musklen i 60 sekunder mellem hver stimulus. Disse foreløbige tetaniske sammentrækninger stabiliserer musklen for efterfølgende målinger. </td></tr><tr><td> 2. Optimal muskel længde (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 og 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Lad musklen til at slappe i 30 sek mellem hver stimulus. Mål musklen optimal længde ved hjælp af en digital skydelære. </td></tr><tr><td> 3. Single TWItch kraft (Pt) </td><td> Juster hvilespænding til Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Tetanisk muskelkraft </td><td> Juster hvilespænding til Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 og 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Lad musklen til at slappe i 1 minut mellem hver stimulus. Bestem frekvens, der genererer den maksimale absolutte tetanic kraft (Po). </td></tr><tr><td> 5. Excentrisk kontraktion </td><td> Juster hvilespænding til Lo </td><td> Brug den frekvens, der genererer den maksimale tetanic kraft (Po) </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> sidste 200 ms for stimulation varighed </td><td> 0,5 Lo / sek </td><td> Gentag den excentriske kontraktion i 10 cykler med 2 min hvile mellem cykler. </td></tr><tr><td> 6. CSA af EDL muskler </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (muskelmasse (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 er muskler massefylde og 0,44 er den EDL muskel fiberlængde til Lo-forhold. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Måling af passive egenskaber af EDL muskel </td></tr><tr><td> 1. Seks-trins stretching protokol </td><td> Juster hvilespænding til Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sek </td><td> Gentag strækker protokol med en stigning på 10% Lo indtil 160% Lo er nået. Alow 1,5 sek mellem stretch cyklusser. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Juster hvilespænding til Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sek </td><td> SSR beregnes ved at dividere forskellen i spænding med time forløbet mellem to tidspunkter i en tidsramme. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 Måling de kontraktile egenskaber TA musklen </td></tr><tr><td> 1. Varm op </td><td> 4,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Hvil musklen i 60 sekunder mellem hver stimulus. </td></tr><tr><td> 2. Optimal muskel længde (Lo) </td><td> 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 og 7,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Lad musklen til at slappe i 30 sek mellem hver stimulus. Mål musklen optimal længde ved hjælp af en digital skydelære. </td></tr><tr><td> 3. CSA af TA musklen </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (muskelmasse (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 er den TA muskel fiberlængde til Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Parametre til vurdering af de mekaniske egenskaber af de EDL og TA muskler. <table border="1"><tbody><tr><td> Strain </td><td> Alder (måned) </td><td> Kropsvægt (g) </td><td> EDL vægt (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> MDX </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Morfometriske egenskaber EDL muskler. *, Værdien i mdx mus er signifikant forskellig fra aldersmatchede BL10 mus. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figur 1. En skematisk diagram over skræddersyet mus dissektion bord. Dissektionen bord er lavet af en ½ cm tyk plexiglas og blev fremstillet på det institutionelle butikken. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figur 2. En serie af digitale billeder der viser trinnene at binde en dobbelt knude efterfulgt af en sløjfe knude i MTJ. Asterisk, atEDL muskel, pil, den distale sene af EDL muskel. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figur 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figur 3. Et skematisk diagram over skræddersyet platform for in situ TA muskelfunktion assay. Den plexiglas dyr platformen og den rustfri knæet holder var designet til at montere på 809B in situ mus apparat. *, Rustfrit stål stang (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR), #, Universal elektrode holder (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR), §, elektrode vedhæftet stang (Cat # MPR-3,0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Sylgard blok. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;altid&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figur 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figur 4. Repræsentative resultater for de kontraktile og passive egenskaber EDL muskler. Sammentrækning egenskaber af EDL muskler er kendetegnet ved den specifikke twitch kraft (A), den specifikke tetanisk kraft (B), tiden til maksimal spænding (C) og den halve relaksationstid (D). De passive egenskaber af EDL muskler bedømmes af spændings-belastnings-profilen (E) og SSR. *, Mdx-mus er væsentligt forskellige fra alders-matchede BL10 mus.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol at JoVE.com

Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol (Video) | JoVE

Ændringer i lemmer muskel kontraktile og passive mekaniske egenskaber er vigtige biomarkører for muskelsygdomme. Dette håndskrift beskriver fysiologiske assays til at måle disse egenskaber i det murine extensor digitorum longus og tibialis anterior muskler.

Evaluering af muskelfunktionen af ​​extensor digitorum longus musklen<em&gt; Ex vivo</em&gt; Og tibialis anterior muskel<em&gt; In situ</em&gt; I Mus

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy Video (Video) | JoVE

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties Video (Video) | JoVE

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles Video (Video) | JoVE

Ex Vivo Vurdering af kontraktilitet, udmattelse og Alternans i isoleret skeletmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers Video (Video) | JoVE

Vurdering af Calcium Sparks i intakte Skeletal muskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming Video (Video) | JoVE

Generering af Myospheres Fra hESCs ved Epigenetisk Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method Video (Video) | JoVE

Detektion og analyse af DNA-skader i Mouse Skeletmuskel<em&gt; In Situ</em&gt; Brug af TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function Video (Video) | JoVE

Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Model af smidig muskelcelle proliferation og endotelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry Video (Video) | JoVE

En hurtig Automatiseret Protokol for muskelfiber Population Analysis i rottemuskel tværsnit Brug af myosin Heavy Chain Immunhistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells Video (Video) | JoVE

In situ Immunofluorescerende farvning af autophagy i muskelstamceller

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices Video (Video) | JoVE

Isolering af humane ventrikulære kardiomyocytter fra Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...