Name: evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice
Uploaded: 2013-02-09T14:00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (AR-49419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD), en NIH opleiding subsidie ​​T90DK70105 (CH).

1. Evaluatie van de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL Muscle Ex vivo De contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier worden gemeten ex vivo met behulp van de Aurora Wetenschappelijk in vitro spiertest systeem. Zie Tabel 1 voor materialen en apparatuur. 1,1 Apparatuur voorbereiding <ol><li> Monteer de weefsel-orgaan-bad door zich te verzekeren van de oxytube om het water-jacket weefsel bad. Bevestig de geassembleerde bad om de spier montageonderdelen. Sluit de gasleiding aan de oxytube. Bevestig de watercirculatie lijnen naar de water-jacket weefsel bad en plaats de naald ventiel in het bad drainage. </li><li> Zet de circulerende waterbad en de temperatuur op 30 ° C 7. Toestaan ​​5 PSI (pounds per square inch) van 95% O 2 -5% CO2 stromen door de oxytube. Vul het bad met buffer Ringer&#39;s. Equilibreren de buffer minstens10 min met een constante gasstroom door instelling van de klep oxytube. </li><li> Zet de instrumenten (stimulator, dual-mode hendel systeem, en signaal-interface). Laad de dynamische spiercontrole (DMC) software volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 1,2 EDL spier dissectie Alle dierlijke studies moeten worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. <ol><li> Verdoven de muis met intraperitoneale injectie van 2,5 ul / g lichaamsgewicht van het verdovingsmiddel cocktail (zie materialen sectie). Gedurende de chirurgische procedure, is de diepte van sedatie gecontroleerd door het uitvoeren van een pinch toe. Een supplement van 10% van de initiële dosis anestheticum wordt toegediend als nodig is om het dier onder verdoving te houden. Scheer het achterste lidmaat. Handhaven van het lichaam kerntemperatuur bij 37 ° C voorafgaand aan dissectie procedure door de muis op een verwarmingskussen. De lichaamstemperatuur bewaakt door voortdurend meten van de rectale temperature met een thermische probe. </li><li> Plaats de muis rug op de dissectie board (figuur 1). Verwijder het been huid om de achterste ledematen spieren bloot te leggen. Bevestig het been op de Sylgard blok met twee naaister pennen, een in de voet en de andere in de gracilis spier. Plaats een warmtelamp boven de muis lichaam de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C. Voortdurend superfuse alle zichtbare spieren met buffer Ringer&#39;s. Giet het overtollige buffer door middel van een vacuüm lijn. </li><li> Maak de distale TA pees en de extensor ligament onder een stereomicroscoop bij het ontleden van de huid in de richting van de voet. Verwijder voorzichtig de fascia over de TA spier. Snijd de extensoren ligament aan de distale TA pees los te laten. </li><li> Snijd de distale TA pees en gebruik deze om losraken van de TA spier. Verwijder voorzichtig de TA spier aan het proximale bevestiging. Plaats een dun stuk buffer Ringer&#39;s gedrenkte katoenen naast de EDL spier te bloeden veroorzaakt door de breuk van de TA spier vaatstelsel te absorberen. Gebruik de vacuümleiding om overtollige buffer en bloed te verwijderen. </li><li> Maak een dubbele vierkante knopen gevolgd door een lus knoop met een brood zijden hechtdraad in de spier pees knooppunt (MTJ) van het distale EDL spier (figuur 2). Een insnijding in het distale deel van de m. biceps femoris het proximale EDL spier bloot. Herhaal dezelfde reeks knopen (figuur 2) op MTJ van de proximale EDL pees. Bevestig de hefboom haak om ofwel de proximale of de distale knopen met een dubbele platte knoop met dezelfde hechtdraad lijn. Snijd de resterende hechting. </li><li> Snij de proximale EDL pees boven de proximale hechtdraad knoop. Til de EDL spier met de haak en snijd het vaatstelsel onder de spier. Snijd de distale EDL pees inferieur aan de distale hechtdraad knoop om de EDL spier te verwijderen uit het achterste lidmaat. Bedek de blootgestelde achterste ledematen met een stuk buffer Ringer&#39;s gedrenkte katoen. </li><li> Bevestig de haak als de hendel. Verticaal uitlijnen de spiertussen twee elektroden. Bevestig de distale hechting aan de vaste post. Til het weefsel bad onder te dompelen de spier in de buffer Ringer&#39;s. Stel de rustplaats spanning tot 1,0 g met de dubbele grof / fijn translatietafel en laat de spier equilibreren ten minste 10 minuten. </li></ol> 1,3 Het meten van de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier Tabel 2 gebruikt om de parameters in de DMC software voor elk van de volgende metingen. Analyseer de gegevens met behulp van de dynamische spier-analyse (DMA) software. 1.3.1 Het meten van de contractiele eigenschappen van de EDL spier <ol><li> Stimuleren van de EDL spier drie keer bij 150 Hz met 60 sec uit elkaar om de spier 8 stabiliseren. </li><li> Stimuleren van de EDL spier op verschillende rust spanningen op de optimale lengte (Lo) te bepalen. De optimale lengte is de lengte waarbij spier ontwikkelt maximum twitch spanning. Laat de spierontspannen 2 min. </li><li> Pas de rust spanning naar Lo. Meet spierkracht op een twitch stimulatie. Bepaal de absolute twitch kracht (Pt), tijd tot piek spanning (TPT) en half relaxatietijd (½ RT) van het Pt. Laat de spieren te ontspannen gedurende 2 minuten. </li><li> Pas de rust spanning naar Lo. Meet tetanische spierkracht gegenereerd op verschillende stimulatie frequenties (50, 80, 100, 120, 150 en 200 Hz). Bepaal de absolute maximale tetanische spierkracht (Po), waar spierkracht bereikt de maximale. Meet de TPT en ½ RT van de Po 9. </li><li> Laat de spieren te ontspannen gedurende 5 minuten. Pas de rust spanning naar Lo. Breng 10 cycli van excentrische contracties met 2 min rust tussen de cycli. Bereken het relatieve kracht verlies van de Po na elke cyclus van excentrische contractie. </li><li> Maak de EDL spier van het apparaat en snijd de pezen aan de hechtdraad site. Bepaal de spier natte gewicht en bereken de spier dwarsdoorsnede (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Het meten van de passieve eigenschappen van de EDL spier <ol><li> Prepareer de contralaterale EDL spier en bevestig deze aan het apparaat, zoals beschreven in paragraaf 1.2, stap 2 tot 7. </li><li> Betreft de EDL spier om een ​​zes-stappen stretching protocol waar de spier wordt tot 160% Lo stress met een toename van 10% Lo. Analyseer de spanning-rek profiel 6. </li><li> Evalueer de viskeuze eigenschap van de EDL spier door het meten van de spanning relaxatiesnelheid (SRR) bij de volgende tijdsintervallen na rekken en houdt de spier 10% Lo: van piek tot 0,1 s post-piek (pp), 0,1 tot 0,2 s pp, 0,2 tot 0,5 s pp, 0,5 tot 1s pp en van 1 tot 1,5 s pp </li><li> Aan het einde van de studie euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en / of onthoofding terwijl de muis nog onder narcose. Maak de EDL spier van het apparaat en snijd de pezen aan de hechtdraad site. Bepaal de spier natte gewicht en bereken de spier kruis sectional gebied (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluatie van de contractiele eigenschappen van de TA spier in situ De contractiele eigenschappen van de TA spier worden gewaardeerd in de Aurora Wetenschappelijk in situ spiertest systeem. Zie Tabel 1 voor materialen en apparatuur. 2,1 Apparatuur voorbereiding <ol><li> Verwarm de thermo gecontroleerde dierlijke stadium tot 37 ° C met de circulerend waterbad. </li><li> Zet de instrumenten (stimulator, dual-mode hendel systeem, en signaal-interface). Laad de DMC-software volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 2.2 Voorbereiding van de TA spier voor in situ krachtmeting <ol><li> Verdoof de muis, scheren het achterste lidmaat en bloot de TA spier zoals beschreven in stappen 1 tot 3 in paragraaf 1.2. </li><li> Maak een dubbele platte knoop rond de knieschijf ligament USIng een brood zijden hechtdraad. Maak een dubbele platte knoop, gevolgd door een lus knoop aan de MTJ van de distale TA spier (figuur 2), das nog een dubbele platte knoop het verlaten van een ~ 10 mm loop van het distale TA pees knoop met dezelfde hechtdraad lijn. Plaats de tweede dubbele platte knoop aan de zijkant van de lus. </li><li> Verwijder de pennen van het achterste lidmaat en plaats het dier vatbaar. Maak de m. biceps femoris. Maak een insnijding in de middellijn van de nervus zenuw te onthullen. Maak een dubbele platte knoop rond het proximale uiteinde van de nervus ischiadicus. Trim een ​​zijde van de sutuurlijnen en snijd de zenuw boven de knoop. Voorzichtig, trek de heupzenuw in de richting van de knie met behulp van de hechting en schakelt u het omliggende bindweefsel om gratis ~ 5 mm van de lengte. Laat de zenuw niet rekken tijdens deze procedure en voortdurend de zenuw superfuse met belsignaal buffer. </li><li> Bereid de contralaterale TA spier, zoals beschreven in de stappen 1 tot 3. Betrekking hebben op een van de achterste ledematen blootgesteld met een stuk Ringer de buffer geweekt katoen. Voortdurend superfuse beide achterpoten met voorverwarmd (37 ° C) buffer Ringer&#39;s. Verwijder het teveel aan buffer door middel van een vacuüm lijn. </li><li> Plaats het dier gevoelig op het dier platform. Bevestig de knie klemhouder om het dier platform en zet beide knieën naar de metalen pin met dubbele vierkante knopen met behulp van de patella ligament hechtdraad lijnen. Pin beide voeten op de Sylgard blok met behulp van naaister pinnen. Zet het dier platform op de thermo-gecontroleerde fase. Plaats de warmtelamp het dier kernlichaam temperatuur op 37 ° C. </li><li> Zet de elektrode houder om het dier platform en leg de heupzenuw op de elektrode met behulp van de hechting. Houd de elektrode uit de buurt van het achterste lidmaat spieren. Snijd de distale TA pees van de onbedekte achterste ledematen op de MTJ hechtdraad site. Bevestig de distale TA pees hechtdraad lus als de hendel haak. Bedek het blootgestelde achterste ledematen spieren met buffer een warme Ringer&#39;s gedrenkte katoen. </li></ol><ol><li> Gebruik Tabel 2 om de parameters in te stellen in de DMC-software. Volg hetzelfde protocol beschreven in paragraaf 1.3.1 van de contractiele eigenschappen van de TA spier te bepalen. Analyseer de gegevens met behulp van de DMA-software. </li><li> Na contractiele meten van de eigenschappen, maak de distale TA pees hechtdraad lus van de leveller arm haak. Verwijder de TA spier. Bepaal de spier natte gewicht en bereken de CSA 10. </li><li> Meet de contractiele eigenschappen van de contralaterale TA spier volgens stappen 1 tot 3 hierboven beschreven. Euthanaseren de muis volgens de institutionele richtlijnen aan het einde van de studie. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit protocol hebben we geïllustreerd fysiologische assays voor het meten van de contractiele eigenschappen en passieve EDL de spier en de contractiele eigenschappen van de spier TA. Een belangrijk punt van zorg in de spier fysiologie studies is de zuurstofvoorziening van de doelspier. Voor grote spieren (zoals TA spier), wordt het in situ benadering voorkeur omdat zuurstofdiffusie uit buffer Ringer&#39;s kan het midden van de spier niet bereiken in een in vitro assay. In situ aanpak niet normale bloedtoevoer en hypoxie-geassocieerde verstoren kunstmatige effecten worden vermeden. De EDL spier is een van de meest gebruikte spier in fysiologie studie. Voldoende zuurstof van de gehele spier kan worden bereikt in een in vitro systeem vanwege de kleine grootte van de spier. Verder het in vitro systeem biedt een gesloten milieu de concentraties van ionen (Ca 2 +, Na + en K +) en chemisch manipulerencals (ATP en glucose) die nodig zijn voor een optimale spierkracht generatie. Dit biedt een geweldige kans om het effect van deze variabelen op kracht productie te bestuderen. Nauwkeurige meting van de contractiele en passieve eigenschappen van het ledemaat spier is essentieel voor de skeletspier functie te bestuderen. Kenmerkende veranderingen van deze eigenschappen worden vaak beschouwd als de kenmerken van verschillende spierziekten. Veranderingen in deze parameters zijn belangrijk indicatoren te bepalen of een experimentele therapie effectief is of niet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal </td><td> Fabrikant </td><td></td><td> Specificaties en opmerkingen </td></tr><tr><td> Tissue-orgaanbad </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Water-jacket weefsel bad (Cat # 158351-LL), Zuurstof dispergeerinrichting buis (Cat # 160192), Luer klep (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Circulerend waterbad </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gasmengsel </td><td> Airgas National, Charlotte, NC, USA </td><td></td><td> 95% O2 en 5% CO2 </td></tr><tr><td> In vitro assay inrichting spierfunctie </td><td> Aurora Wetenschappelijk, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Het systeem bestaat uit een stimulator (Model # 701A), een dual-mode hefsysteem (Model # 300C of 305C), een signaal interface (Model # 604B) en een test apParatus (Model # 800A) om verticaal te monteren weefsel orgaanbad </td></tr><tr><td> In vitro assay software spierfunctie </td><td></td><td></td><td> Dynamic spiercontrole (DMC) software en dynamische spiercontrole data analyse (DMA) software </td></tr><tr><td> Muis anesthesie cocktail gemengd in 0,9% NaCl </td><td> Raadpleeg de institutionele richtlijnen </td><td></td><td> Ketamine (25 mg / ml), xylazine (2,5 mg / ml) en acepromazine (0,5 mg / ml). Gedurende de chirurgische procedure, kan een supplement van 10% van de initiële dosis nodig moeten dierlijke onder verdoving. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Wereld Precision Instrument </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte plexiglas dissectie boord </td><td> In ontworpen huis </td><td></td><td> Zie Figuur 1 </td></tr><tr><td> Warmtelamp </td><td> Tensor Lighting Company,Boston, MA, USA </td><td></td><td> 15 Watt lamp om de muis te warm te houden tijdens dissectie </td></tr><tr><td> Ringer-Buffer </td><td> Chemische stoffen worden ingekocht bij Fisher Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten </td><td></td><td> Samenstelling in mM: 1,2 NaH 2PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO3 (Cat # S233), 2 CaCl2 (Cat # C79) en 10 glucose (Cat # D16). Individueel Los chemicaliën en mengen in de volgorde zoals hierboven aangegeven. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stereo dissectiemicroscoop </td><td> Nikon, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissectie-instrumenten </td><td> Fine Science Tools, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Grof tang, grof scharen, fijn pincet (recht en hoek van 45 °) </td></tr><tr><td> Gevlochten zijden hechtdraad # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Suturen, Norwalk, CT, Verenigde Staten </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte RVS haak </td><td> Kleine onderdelen, Inc </td><td></td><td> 2&#39;&#39; lange S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) voor krachtopnemer 305C of 2,5&#39;&#39; lange S / S 304V (0,012&#39;&#39; diameter) voor transducer 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> In situ spierfunctie testsysteem </td><td> Aurora Wetenschappelijk, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Het systeem (809B, in situ muis toestellen) bestaat uit een stimulator (Model # 701B), een dual-mode hefboomsysteem (Model # 305C), een signaal interface (Model # 604A) en een thermo gecontroleerde voetplaat inrichting (Model # 809A ) </td></tr><tr><td> In vitro assay software spierfunctie </td><td> Aurora Wetenschappelijk, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Dynamic spiercontrole (DMC) software en dynamische spiercontrole data analyse (DMA) software </td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte TA test dier-platform </td><td> In ontworpen huis </td><td></td><td> Zie Afbeelding 2 </td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte RVS haak </td><td> Kleine onderdelen, Inc </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; lange S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) </td></tr><tr><td> Custom-made 25G platina-elektroden </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> Soldeer twee 0,016&#39;&#39; dik platina draden twee elektrische draden 24G </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Materialen en apparatuur.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Bewegingen van het lichaam worden voornamelijk geleverd door de mechanische werking van de skeletspieren. Skeletspier bestaat uit verschillende bundels myovezels die ommanteld door intramusculaire bindweefsel. Elke myofiber bevat vele myofibrillen die in de lengte langs de lengte van de myofiber. Myofibrillen zijn het contractiele apparaat van spieren en zij bestaan ​​uit herhaalde eenheden bekend als contractiele sarcomeren. Een sarcomeer eenheid bevat actine en myosine filamenten die zijn verdeeld door de schijven en Z titin eiwit. Mechanische functie van skeletspier wordt bepaald door de contractiele en passieve eigenschappen van de spier. De contractiele eigenschappen worden gebruikt om de hoeveelheid kracht die tijdens spiercontractie tijd troepenmacht en tijd van spierontspanning karakteriseren. Elke factor die spiercontractie (zoals interactie tussen actine en myosine filamenten, homeostase van calcium, ATP / ADP verhouding, etc.) beïnvloedt beïnvloedt de contractiele properties. De passieve eigenschappen verwijzen de elastische en visceuze eigenschappen (stijfheid en viscositeit) van de spier in afwezigheid van krimp. Deze eigenschappen worden bepaald door de extracellulaire en intracellulaire structurele componenten (zoals titin) en bindweefsel (vooral collageen) 1-2. De contractiele en passieve woningen zijn twee onafscheidelijke aspecten van spierfunctie. Zo wordt flexie bereikt door samentrekking van spieren in het voorste compartiment van de bovenarm en passieve rek van de spieren in het achterste compartiment van de bovenarm. Om echt te begrijpen spierfunctie, moeten zowel contractiele en passieve eigenschappen worden bestudeerd. De contractie en / of passieve mechanische eigenschappen van de spier worden vaak gecompromitteerd in spierziekten. Een goed voorbeeld is de ziekte van Duchenne (DMD), een ernstige spier slopende ziekte veroorzaakt door tekort aan dystrofine 3. Dystrofine een cytoskelet protein dat stabiliseert de spiercelmembraan (sarcolemma) tijdens spiercontractie 4. In afwezigheid van dystrofine, wordt de sarcolemma beschadigd door de afschuifkracht gegenereerd tijdens overbrenging. Dit membraan scheuren start een kettingreactie die leidt tot spier-celdood en verlies van contractiele machines. Bijgevolg wordt spierkracht verminderd en dode myovezels vervangen door fibrotisch weefsel 5. Deze latere verandering is een verbetering spierstijfheid 6. Nauwkeurige meting van deze veranderingen geeft belangrijke leidraad voor progressie van de ziekte te evalueren en om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe genen / cel / farmacologische interventies te bepalen. Hier presenteren we twee methodes om zowel de contractiele en passieve mechanische eigenschappen van de m. extensor digitorum longus (EDL) spier en de contractiele eigenschappen van de tibialis anterior (TA) spier te evalueren.

De volgende resultaten zijn een weergave van onze vorige rapporten 6,9. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde. Tabel 3 toont de eigenschappen van de morfometrische EDL spier in normale BL10 en dystrofine-deficiënte (mdx) muizen van 4 tot 6 maanden. Figuur 4 toont representatieve contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier van BL10 en mdx muizen. De contractiele eigenschappen van de EDL spier worden beschreven door de volgende bepalingen, met inbegrip van de specifieke (absolute kracht gedeeld door de CSA) twitch kracht (Figuur 4A), specifieke maximale tetanische kracht (Figuur 4B), TPT en ½ RT van de absolute maximale tetanische kracht (Figuur 4C en D). De TPT en ½ RT kan ook berekenen worden van de absolute twitch kracht. De spanning-rek profiel (Figuur 4E) en SRR (figuur 4F) eenopnieuw gebruikt om de passieve eigenschappen van de EDL spier te beschrijven. Afwezigheid van dystrofine heeft een grote invloed op de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier 6,9. Specifieke twitch en tetanische krachten aanzienlijk verminderd in de mdx EDL spier. Het TPT is aanzienlijk sneller, terwijl de ½ RT is significant langzamer in de mdx EDL spier. De spanning-rek profiel suggereert dat stijfheid wordt significant verhoogd in de mdx EDL spier. De mdx EDL spier levert ook een aanzienlijk veel hoger weerstandskracht (passieve stress) vóór het bereiken van de piek stress, terwijl de post-piek spanningen leidt dit veel sneller. Verder is de SRR significant hoger in de mdx EDL spier vergeleken met die van de BL10 EDL spier. Statistische analyse Statistische significantie tussen twee groepen wordt geanalyseerd door de Student t-test. Voor statistical belang tussen meerdere groepen, One-way of twee-weg ANOVA-analyse, gevolgd door Bonferroni post hoc analyse is aan te bevelen het gebruik van de SAS-software (SAS Institute Inc, Cary, NC). Verschil significant beschouwd bij p &lt;0,05. Tabel 1. Materialen en apparatuur. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Experiment </td><td class="jove_content_small"> Resting spanning (gram) </td><td class="jove_content_small"> Puls frequentie (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Pulsbreedte (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stimulatie duur (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch lengte </td><td class="jove_content_small"> Stretch duur (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch tarief </td><td class="jove_content_small"> Reacties </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. Evaluatie van de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier ex vivo </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Het meten van de contractiele eigenschappen van de EDL spier </td></tr><tr><td> 1. Opwarmen </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Rest de spier gedurende 60 sec tussen elke stimulus. Deze voorlopige tetanische contracties stabiliseren van de spieren voor de volgende metingen. </td></tr><tr><td> 2. Optimale spierlengte (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 en 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Laat de spieren te ontspannen gedurende 30 seconden tussen elke stimulus. Meet de spier optimale lengte met behulp van een digitale schuifmaat. </td></tr><tr><td> 3. Single TWItch kracht (Pt) </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Tetanische spierkracht </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 en 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Laat de spieren te ontspannen gedurende 1 minuut tussen elke stimulus. Bepaal de frequentie die de maximale absolute tetanische kracht (Po) genereren. </td></tr><tr><td> 5. Excentrische contractie </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td> Gebruik de frequentie die de maximale tetanische kracht (Po) genereert </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> laatste 200 ms van de stimulatie duur </td><td> 0,5 Lo / sec </td><td> Herhaal de excentrische contractie gedurende 10 cycli met 2 min rust tussen de cycli. </td></tr><tr><td> 6. CSA van de EDL spier </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (spiermassa (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 is de spier dichtheid en 0,44 is EDL spiervezels lengte verhouding Lo. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Het meten van de passieve eigenschappen van de EDL spier </td></tr><tr><td> 1. Zes stappen stretching protocol </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> Herhaal de stretching-protocol met een toename van 10% Lo tot 160% Lo is bereikt. Alow 1,5 sec tussen stretch cycli. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> SSR wordt berekend door het verschil in de spanning met de time verstreken tussen twee tijdstippen in een tijdsbestek. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 Het meten van de contractiele eigenschappen van de TA spier </td></tr><tr><td> 1. Opwarmen </td><td> 4,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Rest de spier gedurende 60 sec tussen elke stimulus. </td></tr><tr><td> 2. Optimale spierlengte (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 en 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Laat de spieren te ontspannen gedurende 30 seconden tussen elke stimulus. Meet de spier optimale lengte met behulp van een digitale schuifmaat. </td></tr><tr><td> 3. CSA van de TA spier </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (spiermassa (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 is TA spiervezels lengte Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Parameters voor de evaluatie van de mechanische eigenschappen van de EDL en TA spieren. <table border="1"><tbody><tr><td> Spannen </td><td> Leeftijd (maand) </td><td> Lichaamsgewicht (g) </td><td> EDL gewicht (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Morfometrische eigenschappen van de EDL spier. *, De waarde in mdx muizen significant verschilt van die van vergelijkbare leeftijd BL10 muizen. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figuur 1. Een schematische weergave van de op maat gemaakte muis dissectie boord. De dissectie board is gemaakt van een ½ cm dik plexiglas en werd vervaardigd bij de institutionele winkel. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figuur 2. Een reeks van digitale beelden die de stappen van het leggen van een dubbele platte knoop gevolgd door een lus knoop aan het MTJ. Asterisk deEDL spier, Pijl, de distale pees van de EDL spier. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figuur 3. Een schematisch diagram van de maat platform in situ TA spierfunctie assay. Plexiglas dier platform en de roestvrijstalen houder knie ontworpen voor montage op de 809B in situ muis inrichting. *, Roestvrijstalen stang (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR), #, Universele elektrode houder (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR), §, elektrode bevestiging stang (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Sylgard blok. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;altijd&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figuur 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figuur 4. Representatieve resultaten voor de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier. De contractiele eigenschappen van de EDL spier worden gekenmerkt door de specifieke werking twitch (A), de specifieke tetanische kracht (B) de tijd tot maximale spanning (C) en de half relaxatietijd (D). De passieve eigenschappen van de EDL spier worden beoordeeld door de stress stam profiel (E) en de SSR. *, Mdx muizen zijn significant verschillend van BL10 muizen leeftijd gematchte.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol at JoVE.com

Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol (Video) | JoVE

Veranderingen in de ledematen spieren contractiele en passieve mechanische eigenschappen zijn belangrijk biomarkers voor spierziekten. Dit manuscript beschrijft fysiologische tests om deze eigenschappen te meten in het muizen extensor digitorum longus en m. tibialis anterior.

Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; En Voorste scheenbeenspier Spier<em&gt; In situ</em&gt; In Muizen

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy Video (Video) | JoVE

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties Video (Video) | JoVE

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles Video (Video) | JoVE

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers Video (Video) | JoVE

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming Video (Video) | JoVE

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method Video (Video) | JoVE

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Met behulp van de TUNEL Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function Video (Video) | JoVE

Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt<em&gt; In Vivo</em&gt; Model van gladde spiercel proliferatie en endotheliale functie

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry Video (Video) | JoVE

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells Video (Video) | JoVE

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices Video (Video) | JoVE

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...