Name: evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice
Uploaded: 2013-02-09T14:00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (AR-49419, DD), muskeldystrofi Association (DD), og NIH trening stipend T90DK70105 (CH).

1. Evaluering av Kontraktile og passiv Egenskaper av EDL Muscle Ex vivo Kontraktile og passiv egenskaper EDL muskelen måles ex vivo ved hjelp av Aurora Scientific i vitro muskel testsystem. Se Tabell 1 for materialer og utstyr. 1.1 Utstyr forberedelse <ol><li> Montere vev-organbad ved å sikre oxytube til vann-jakke vev bad. Fest den sammensatte bad til muskel montering apparatet. Koble gassledningen til oxytube. Fest vannsirkulasjon linjer til vann-jakke vev bad og plasser nåleventilen i badekaret drenering. </li><li> Slå på sirkulerende vannbad og justere temperaturen til 30 ° C 7. Tillate 5 PSI (pounds per square inch) av 95% O 2 -5% CO 2 å strømme gjennom oxytube. Fyll badekaret med Ringer buffer. Stabilisere bufferen for minst10 min med en jevn gasstrøm ved å justere oxytube ventilen. </li><li> Slå på instrumentene (stimulator, dual-mode spaken system, og signal grensesnitt). Laste den dynamiske muskel kontroll (DMC) programvare i henhold til produsentens instruksjoner. </li></ol> 1,2 EDL muskel disseksjon Alle dyrestudier må godkjennes av det institusjonelle Animal Care og bruk komité. <ol><li> Anesthetize musen med intraperitoneal injeksjon av 2,5 pl / g kroppsvekt av narkosen cocktail (se materialer delen). Gjennom den kirurgiske prosedyren, ble av sedasjonsdybden kontrolleres ved å utføre en tå klype. Et tillegg på 10% av den initiale bedøvelse dosen administreres når det er nødvendig for å holde dyret i narkose. Barbere hind lem. Opprettholde kroppens kjernetemperatur ved 37 ° C før disseksjon prosedyre ved å plassere musen på en varmepute. Kroppstemperaturen overvåkes av konstant måle rektal Temperature bruker en termisk probe. </li><li> Plasser musen liggende på disseksjon brett (figur 1). Trekk av beinet huden å avsløre de hind lem muskler. Fest beinet på sylgard blokken ved hjelp av to sydame pins, en i foten og den andre i gracilis muskelen. Plasser en varmelampe ovenfor musen kroppen for å opprettholde kjernen kroppstemperatur ved 37 ° C. Stadig superfuse alle utsatte muskler med Ringer buffer. Drenere overflødig buffer gjennom et vakuum linje. </li><li> Utsett distale TA sene og extensor ligament under en stereomikroskop ved å dissekere huden mot foten. Fjern forsiktig fascia dekker muskelen. Kutt extensor ligament å slippe den distale TA sene. </li><li> Skjær den distale TA sene og bruke den til å skrelle av med muskelen. Fjern forsiktig med muskelen på sin proksimale vedlegg. Legg en tynn stykke Ringer buffer gjennomvåt bomull ved siden av EDL muskelen til å absorbere blødning forårsaket av brudd på muskelen blodkar. Bruk vakuumledning for å fjerne overskudd buffer og blod. </li><li> Tie et dobbelt kvadrat knop etterfulgt av en løkke ved hjelp av en knute brød silke sutur på muskel sene krysset (MTJ) av distale EDL muskelen (figur 2). Gjøre et snitt i den distale delen av biceps femoris muskelen å eksponere den proksimale EDL muskel. Gjenta det samme settet av knop (figur 2) ved MTJ av proksimale EDL sene. Fest hevarmen kroken til enten den proksimale eller distale knop med en dobbel firkantet knute ved hjelp av samme sutur linje. Klipp av de resterende sutur linjen. </li><li> Skjær den proksimale EDL sene overlegen til den proksimale sutur knute. Løft opp EDL muskel med kroken og kuttet blodkar under muskelen. Skjær den distale EDL sene dårligere enn distale sutur knute for å fjerne EDL muskel fra den hind lem. Dekk den eksponerte hind lem med et stykke Ringer buffer gjennomvåt bomull. </li><li> Fest kroken til hevarmen. Juster muskel vertikaltmellom to elektroder. Fest distale sutur linjen til den faste stillingen. Løft opp vevet bad å senke muskel i Ringers buffer. Juster hvilested spenningen til 1,0 g ved hjelp av den doble grov / fin oversettelse scenen og tillate muskelen å ekvilibrere i minst 10 min. </li></ol> 1,3 Måle kontraktile og passive egenskaper EDL muskelen Bruk Tabell 2 for å sette opp parametrene i DMC programvare for hver av de følgende målinger. Analysere data ved hjelp av den dynamiske muskler analyse (DMA) programvare. 1.3.1 Måle kontraktile egenskaper EDL muskelen <ol><li> Stimulere EDL muskel tre ganger på 150 Hz med 60 sek fra hverandre for å stabilisere musklene 8. </li><li> Stimulere EDL muskel på ulike hvile spenninger for å bestemme den optimale lengden (Lo). Den optimale lengden er lengden på hvilken muskel utvikler maksimal twitch spenning. La muskelen tilslappe i 2 min. </li><li> Juster hvile spenning til Lo. Mål muskel kraft ved ett rykk stimulering. Bestem den absolutte rykk kraft (Pt), tid til maksimal spenning (TPT) og halvparten tid for avslapping (½ RT) av Pt. La muskelen til å slappe av i 2 min. </li><li> Juster hvile spenning til Lo. Måle tetanic muskel kraft generert ved forskjellige stimulering frekvenser (50, 80, 100, 120, 150 og 200 Hz). Bestem den absolutte maksimal tetanic muskel kraft (Po) der muskel kraft når den maksimale. Mål TPT og ½ RT av Po 9. </li><li> La muskelen til å slappe av i 5 min. Juster hvile spenning til Lo. Påfør 10 sykluser av eksentriske kontraksjoner med 2 min hvile mellom sykluser. Beregn den relative kraft tapet av Po etter hver syklus av eksentriske sammentrekning. </li><li> Løsne EDL muskel fra apparatet og kutte sener på sutur nettstedet. Bestem muskel våtvekt og beregne muskel tverrsnittsareal (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Måle passive egenskapene EDL muskelen <ol><li> Dissekere kontralaterale EDL muskel og fest den til apparatet som beskrevet i avsnitt 1.2, trinn 2 til 7. </li><li> Subject EDL muskel til en seks-trinns strekker protokoll hvor muskelen er anstrengt til 160% Lo med en økning på 10% Lo. Analyser stress-strain profil 6. </li><li> Vurdere tyktflytende eiendom EDL muskel ved å måle spenningsavlastende rate (SRR) på følgende tidsrammer etter forlengelse og holde muskelen på 10% Lo: fra topp til 0.1s post-peak (pp), fra 0,1 til 0,2 S pp, fra 0,2 til 0,5 s pp, fra 0,5 til 1s pp og fra 1 til 1.5s pp. </li><li> Ved slutten av studien, avlive musen ved cervical dislokasjon og / eller halshogging mens musen er fortsatt under anestesi. Løsne EDL muskel fra apparatet og kutte sener på sutur nettstedet. Bestem muskel våt vekt og beregne muskel kryss sectional område (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluering av Kontraktile Egenskaper for TA muskel i situ Kontraktile egenskaper med muskelen måles i den Aurora Scientific i situ muskel testsystem. Se Tabell 1 for materialer og utstyr. 2.1 Utstyr forberedelse <ol><li> Varme opp termo-kontrollert dyr scenen til 37 ° C ved hjelp av det sirkulerende vann-bad. </li><li> Slå på instrumentene (stimulator, dual-mode spaken system, og signal grensesnitt). Laste DMC programvaren i henhold til produsentens instruksjoner. </li></ol> 2.2 Klargjøring av muskelen for in situ kraft måling <ol><li> Anesthetize musen, barbere hind lem og utsett muskelen som beskrevet i trinn 1 til 3 i kapittel 1.2. </li><li> Knyt en dobbel firkant knute rundt patella ligament USIng et brød silke sutur. Tie et dobbelt kvadrat knute etterfulgt av en løkke knute MTJ av distale muskelen (figur 2), knytte annen dobbel firkantet knute forlate en ~ 10 mm sløyfe fra den distale TA sene knute ved hjelp av samme sutur linje. Plassere den andre doble kvadratet knute på siden av sløyfen. </li><li> Fjern pinnene fra hind lem og plassere dyret utsatt. Utsett biceps femoris muskelen. Gjøre et snitt i midtlinjen å avsløre sciatic nerve. Knyt en dobbel firkant knute rundt den proksimale enden av sciatic nerve. Trim ene siden av sutur linjer og kuttet nerve overlegen til knuten. Forsiktig, trekk hoftenervene mot kneet ved hjelp suturlinje og tømme omkringliggende bindevev å fri ~ 5 mm av dets lengde. Ikke strekk nerve i løpet av denne prosedyren og stadig superfuse nerve med ringetonen buffer. </li><li> Klargjør kontralaterale muskelen som beskrevet i trinn 1 til 3. Dekke en av den eksponerte hind lem med et stykke av Ringer buffer gjennomvåt bomull. Stadig superfuse både baklemmene med forvarmet (37 ° C) Ringer buffer. Fjerne overflødig buffer gjennom et vakuum linje. </li><li> Plasser dyret utsatt på dyret plattformen. Fest kneet klemmefeste til dyret plattform og sikre begge knærne til metall pin med doble firkantede knop med patella ligament suture linjer. Pin begge føttene på sylgard blokk med sydame pins. Fest dyr plattformen på termo-kontrollerte scenen. Plasser den varme lampe for å opprettholde dyret kjerne kroppstemperatur ved 37 ° C. </li><li> Fest elektrodeholderen til dyret plattformen og legge hoftenervene på elektroden ved hjelp av sutur linjen. Hold elektroden unna hind lem muskler. Skjær den distale TA sene av det udekkede hind lem på MTJ sutur nettstedet. Fest distale TA sene sutur loop til utløserarmen kroken. Dekk den eksponerte hind lem muskel med en varm Ringer buffer gjennomvåt bomull. </li></ol><ol><li> Bruk Tabell 2 for å angi parametrene i DMC-programvaren. Følg samme protokoll som beskrevet i Seksjon 1.3.1 å bestemme kontraktile egenskaper med muskelen. Analysere data ved hjelp av DMA-programvaren. </li><li> Etter kontraktile eiendom måling, ta av distale TA sene sutur sløyfe fra leveller arm kroken. Ta av muskelen. Bestem muskel våt vekt og beregne CSA 10. </li><li> Mål kontraktile egenskaper kontralaterale muskelen ifølge trinnene 1 til 3 beskrevet ovenfor. Avlive musen i henhold til institusjonelle retningslinjer ved slutten av studien. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

I denne protokollen, har vi illustrert fysiologiske analyser for å måle kontraktile og passive egenskaper EDL muskel og kontraktile egenskaper med muskelen. En stor bekymring i muskelfysiologi studier er oksygenopptaket i mål muskel. For store muskler (eksempel med muskelen) er in situ tilnærmingen foretrekkes fordi oksygendiffusjon fra Ringers buffer ikke kan nå midten av muskelen i en in vitro-analysen. In situ tilnærming ikke forstyrrer normal blodtilførsel og hypoksi-assosiert kunstige effekter unngås. EDL muskelen er en av de mest brukte muskler i fysiologi studie. Tilstrekkelig oksygenering av hele muskelen kan oppnås i en in vitro-system på grunn av den lille størrelsen av muskelen. Videre gir in vitro-system et lukket miljø å manipulere konsentrasjonen av ioner (Ca2 +, Na + og K +) og kjekalier (ATP og glukose) som er nødvendig for optimal muskel kraft generasjon. Dette gir en flott mulighet til å studere effekten av disse variablene på kraft produksjon. Nøyaktig måling av de kontraktile og passive egenskaper lem muskelen er kritisk å studere skjelettmuskelfunksjon. Karakteristiske forandringer av disse egenskapene er ofte betraktet som kjennetegner ulike muskelsykdommer. Endringer i disse parameterne er også viktige indikatorer for å avgjøre om en eksperimentell terapi er effektiv eller ikke.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Produsent </td><td></td><td> Spesifikasjoner og kommentarer </td></tr><tr><td> Vev-organbad </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Vann-jakke vev bad (Cat # 158351-LL), oksygen disperser tube (Cat # 160192), Luer ventil (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Sirkulerende vann bad </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gassblandingen </td><td> Airgas National, Charlotte, NC, USA </td><td></td><td> 95% O 2 og 5% CO 2 </td></tr><tr><td> In vitro muskel funksjon analysen apparater </td><td> Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Systemet består av en stimulator (Model # 701A), en dual-mode spaken systemet (Model # 300C eller 305C), et signal-grensesnitt (Model # 604B) og en test apParatus (Model # 800A) til vertikalt montere vev organbad </td></tr><tr><td> In vitro muskel funksjon analysen programvare </td><td></td><td></td><td> Dynamisk muskel kontroll (DMC) programvare og dynamisk muskel kontroll dataanalyse (DMA) programvare </td></tr><tr><td> Mus anestesi cocktail blandet i 0,9% NaCl </td><td> Referer til institusjonelle retningslinjer </td><td></td><td> Ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) og acepromazin (0,5 mg / ml). Gjennom den kirurgiske prosedyren, kan et tillegg på 10% av den innledende dosen være nødvendig for å holde dyret under anestesi. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Verden Precision Instrument </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> En skreddersydd pleksiglass disseksjon bord </td><td> I huset utformet </td><td></td><td> Se Figur 1 </td></tr><tr><td> Varmelampe </td><td> Tensor Lighting Company,Boston, MA, USA </td><td></td><td> 15 watt lampe å holde musen varme under disseksjon </td></tr><tr><td> Ringer Buffer </td><td> Kjemikalier er kjøpt fra Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td> Sammensetning i mm: 1,2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSo4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 CaCl 2 (Cat # C79) og 10 glukose (Cat # D16). Oppløse kjemikalier individuelt og blande i den rekkefølgen de står ovenfor. Oppbevar ved 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stereo disseksjonsmikroskop </td><td> Nikon, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disseksjonsverktøyer </td><td> Fin Science Verktøy, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Grov tang, grove saks, fine tang (Straight og 45 ° vinkel) </td></tr><tr><td> Flettet silke sutur # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Superaturer, Norwalk, CT, USA </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> En skreddersydd rustfritt stål kroken </td><td> Små deler, Inc. </td><td></td><td> 2&#39;&#39; lang S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) for kraft svinger 305C eller 2,5&#39;&#39; lang S / S 304V (0,012&#39;&#39; diameter) for svinger 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> In situ muskelfunksjon assaysystem </td><td> Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Systemet (809B, in situ mus anordning) består av en stimulator (Model # 701B), en dual-mode spaken systemet (Model # 305C), et signal-grensesnitt (Model # 604A) og en termo kontrollert fotplate apparat (Model # 809A ) </td></tr><tr><td> In vitro muskel funksjon analysen programvare </td><td> Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Dynamisk muskel kontroll (DMC) programvare og dynamisk muskel kontroll dataanalyse (DMA) programvare </td></tr><tr><td> En skreddersydd TA analysen dyr plattform </td><td> I huset utformet </td><td></td><td> Se Figur 2 </td></tr><tr><td> En skreddersydd rustfritt stål kroken </td><td> Små deler, Inc. </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; long S / S 304V (0.18&#39;&#39; diameter) </td></tr><tr><td> Skreddersydde 25g platina elektroder </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> Loddetinn to 0,016&#39;&#39; tykke platina ledninger til to 24G elektriske ledninger </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Materialer og utstyr.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Kroppsbevegelser er hovedsakelig levert av mekanisk funksjon av skjelettmuskulatur. Skjelettmuskulatur består av mange bunter av myofibers som er skjermet av intramuskulære bindevev. Hver myofiber inneholder mange myofibrils som kjører lengderetningen langs lengden av myofiber. Myofibrils er kontraktile apparatet av muskel og de er sammensatt av gjentatte kontraktile enheter kjent som sarcomeres. En sarcomere enheten inneholder aktin og myosin filamenter som fordeles av Z plater og titin protein. Mekanisk funksjon av skjelettmuskulatur defineres av kontraktile og passive egenskaper muskel. Kontraktile egenskaper blir brukt til å karakterisere mengden av kraft som genereres under muskelkontraksjon, tid av makt generasjon og tidspunkt for muskelavslapping. En annen faktor som påvirker muskel sammentrekning (som samspill mellom aktin og myosin filamenter, homeostasis av kalsium, ATP / ADP ratio, etc.) påvirker kontraktile properties. De passive egenskaper refererer til de elastiske og viskøse egenskaper (stivhet og viskositet) av muskelen i fravær av sammentrekning. Disse egenskapene bestemmes av ekstracellulære og intracellulære strukturelle komponenter (for eksempel titin) og bindevev (hovedsakelig kollagen) 1-2. Kontraktile og passive egenskaper er to uatskillelige aspekter muskelfunksjon. For eksempel, er albue fleksjon oppnås ved sammentrekning av musklene i fremre kammer av den øvre arm og passiv strekning av muskler i bakre kammer av den øvre armen. For virkelig å forstå muskelfunksjon, bør begge kontraktile og passive egenskaper bli studert. Kontraktile og / eller passive mekaniske egenskaper av muskel er ofte utsatt i muskelsykdommer. Et godt eksempel er Duchenne muskeldystrofi (DMD), en alvorlig muskelsvinn sykdom forårsaket av dystrophin mangel tre. Dystrophin er en cytoskeletal protei som stabiliserer muskel cellemembranen (sarcolemma) under muskel sammentrekning 4. I fravær av dystrophin blir sarcolemma skadet av skjærkraft generert under kraftoverføring. Denne membranen rive starter en kjedereaksjon som fører til muskel celledød og tap av kontraktile maskineri. Som en konsekvens, er muskel kraft reduseres og døde myofibers erstattes av fibrotiske vev 5. Dette senere endringen øker muskelstivhet 6. Nøyaktig måling av disse endringene gir viktige guide til å vurdere sykdomsutvikling og for å bestemme terapeutisk effekt av romanen genet / celle / farmakologiske tiltak. Her presenterer vi to metoder for å evaluere både kontraktile og passiv mekaniske egenskaper extensor digitorum longus (EDL) muskel og kontraktile egenskaper tibialis anterior (TA) muskel.

Følgende resultater er en representasjon fra våre tidligere rapporter 6,9. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. Tabell 3 viser de morfometriske egenskaper EDL muskelen i normal BL10 og dystrophin-mangelfull (MDX) mus ved 4-6 måneders alder. Figur 4 viser representative kontraktile og passiv egenskaper EDL muskel fra BL10 og mdx mus. Kontraktile egenskaper EDL muskelen er beskrevet av de følgende termer, inkludert den spesifikke (absolutte kraft dividert med CSA) twitch kraft (figur 4A), spesifikk maksimal tetanic kraft (fig. 4B), TPT og ½ RT av absolutt maksimal tetanic kraft (Figur 4C og D). Den TPT og ½ RT kan også beregne fra den absolutte rykk kraft. Stress-strain profil (figur 4E) og SRR (figur 4F) enre brukes for å beskrive de passive egenskapene EDL muskel. Fravær av dystrophin har en betydelig innvirkning på de kontraktile og passive egenskaper EDL muskel 6,9. Spesifikk rykk og tetanic styrker er betydelig redusert i mdx EDL muskel. Den TPT er betydelig raskere mens ½ RT er betydelig tregere i mdx EDL muskel. Stress-strain profil tyder på at stivhet er betydelig økt i mdx EDL muskel. MDX EDL muskelen gir også en betydelig mye høyere motstand kraft (passiv stress) før de når toppen stress, mens de post-peak påkjenninger avta mye raskere. Videre var SRR signifikant høyere i MDX EDL muskelen sammenlignet til den av BL10 EDL muskel. Statistisk analyse Statistisk signifikans mellom to grupper er analysert av Student t-test. For statistical betydning blant flere grupper, Enveis eller toveis ANOVA analyse etterfulgt av Bonferroni post hoc-analyse anbefales å bruke SAS-programvare (SAS Institute Inc., Cary, NC). Forskjellen antas signifikant når p &lt;0,05. Tabell 1. Materialer og utstyr. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Eksperiment </td><td class="jove_content_small"> Resting spenning (gram) </td><td class="jove_content_small"> Puls frekvens (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Pulsbredde (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stimulering varighet (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch lengde </td><td class="jove_content_small"> Strekk varighet (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch rente </td><td class="jove_content_small"> Kommentarer </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. Evaluering av kontraktile og passiv egenskaper EDL muskel ex vivo </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Måle kontraktile egenskaper EDL muskelen </td></tr><tr><td> 1. Varm opp </td><td> 1.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Hvil muskel i 60 sek mellom hvert stimulus. Disse foreløpige tetanic sammentrekninger stabilisere musklene for senere målinger. </td></tr><tr><td> 2. Optimal muskel lengde (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 og 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> La muskelen til å slappe av i 30 sek mellom hvert stimulus. Mål muskel optimal lengde ved hjelp av en digital caliper. </td></tr><tr><td> 3. Enkelt TWItch kraft (Pt) </td><td> Juster hvile spenning til Lo </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Tetanic muskel kraft </td><td> Juster hvile spenning til Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 og 200 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> La muskelen til å slappe av i 1 min mellom hver stimulus. Bestem frekvensen som genererer maksimal absolutte tetanic kraft (Po). </td></tr><tr><td> 5. Eksentrisk kontraksjon </td><td> Juster hvile spenning til Lo </td><td> Bruk frekvens som genererer maksimal tetanic kraft (Po) </td><td> 0.2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> siste 200 ms av stimulering varighet </td><td> 0.5 Lo / sek </td><td> Gjenta den eksentriske sammentrekning i 10 sykluser med 2 min hvile mellom sykluser. </td></tr><tr><td> 6. CSA av EDL muskel </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (muskelmasse (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 er muskeltetthet og 0,44 er EDL muskel fiberlengde til Lo ratio. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Måle passive egenskapene EDL muskelen </td></tr><tr><td> 1. Sekstrinns strekker protokollen </td><td> Juster hvile spenning til Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sek </td><td> Gjenta strekker protokollen med en økning på 10% Lo till 160% Lo er nådd. Alow 1,5 sek mellom strekke sykluser. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Juster hvile spenning til Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sek </td><td> SSR beregnes ved å dividere forskjellen i stress med time gått mellom to tidspunkter i et bestemt tidsrom. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 Måle kontraktile egenskaper med muskelen </td></tr><tr><td> 1. Varm opp </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Hvil muskel i 60 sek mellom hvert stimulus. </td></tr><tr><td> 2. Optimal muskel lengde (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 og 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> La muskelen til å slappe av i 30 sek mellom hvert stimulus. Mål muskel optimal lengde ved hjelp av en digital caliper. </td></tr><tr><td> 3. CSA av muskelen </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (muskelmasse (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 er med muskelen fiber lengde til Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Parametere for vurdering av de mekaniske egenskapene til EDL og TA muskler. <table border="1"><tbody><tr><td> Sil </td><td> Alder (måned) </td><td> Kroppsvekt (g) </td><td> EDL vekt (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32.03 ± 0.57 </td><td> 13.90 ± 0.77 </td><td> 14.09 ± 0.04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35.44 ± 0.42 * </td><td> 16.73 ± 0.42 * </td><td> 13.93 ± 0.05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Morfometriske egenskaper EDL muskel. *, Verdien i mdx mus er vesentlig forskjellig fra alder-matchet BL10 mus. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figur 1. En prinsippskisse av skreddersydde mus disseksjon bord. Disseksjon bord er laget av en ½ tommers tykke plexiglass og ble fabrikkert på institusjonsnivå butikken. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figur 2. En serie av digitale bilder viser de trinn å knytte en dobbel firkantet knute etterfulgt av en løkke knute MTJ. Asterisk, denEDL muskel; Arrow, den distale sene av EDL muskel. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figur 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figur 3. Et skjematisk diagram av den skreddersydde plattform for in situ TA muskelfunksjon analysen. Pleksiglass dyret plattformen og det rustfrie kneet holderen ble utformet for å montere på 809B i situ mus apparat. *, Rustfritt stål stang (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR), #, Universal elektrodeholderen (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, Oregon), §, elektrode vedlegg stang (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, Oregon); **, Sylgard blokk. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figur 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figur 4. Representative resultater for kontraktile og passive egenskaper EDL muskelen. Sammentrekningene egenskaper av EDL muskelen kjennetegnes ved spesifikke twitch kraft (A), den spesifikke tetanic kraft (B), tiden til maksimal spenning (C) og den halve relaksasjonstid (D). De passive egenskapene EDL muskelen blir vurdert av stress belastningen profilen (E) og SSR. *, MDX mus er vesentlig forskjellig fra alder-matchet BL10 mus.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol at JoVE.com

Studying the Extensor Digitorum Longus Muscle and Tibialis Anterior Muscle in Mice | Protocol (Video) | JoVE

Endringer i lem muskel kontraktile og passiv mekaniske egenskaper er viktige biomarkører for muskelsykdommer. Dette manuskriptet beskriver fysiologiske analyser for å måle disse egenskapene i murine extensor digitorum longus og tibialis fremre muskler.

Evaluering av muskel-funksjon av extensor digitorum longus Muscle<em&gt; Ex vivo</em&gt; Og tibialis anterior Muscle<em&gt; I situ</em&gt; I Mus

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy Video (Video) | JoVE

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties Video (Video) | JoVE

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles Video (Video) | JoVE

Ex Vivo Vurdering av kontraktilitet, trettbarhet og Alternans i isolerte skjelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers Video (Video) | JoVE

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming Video (Video) | JoVE

Generering av Myospheres Fra hESCs av Epigenetic Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method Video (Video) | JoVE

Deteksjon og analyse av DNA Skade i Mouse Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Bruke TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function Video (Video) | JoVE

Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av jevn spredning av muskelceller og endotelfunksjon

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry Video (Video) | JoVE

En Rapid Automatisert Protokoll for Muscle Fibre Befolkning Analyse i Rat Muskeltverrsnitt Bruke Myosin Heavy Chain Immunohistokjemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells Video (Video) | JoVE

I situ Immunofluorescerende farging av autophagy i muskelstamceller

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices Video (Video) | JoVE

Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...