Name: optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

אנו מודים פומי קובל טוד Thiele וHerwigBaier (קליפורניה / מקס פלנק) עצה על ניסויי התנהגות וDPSS הליזר הקים; Heesoo קים וקיארה Cerri מקורס נוירוביולוגיה MBL לסיוע בניסויי השף tdTomato; PetronellaKettunen (אוניברסיטת גטבורג ) לשיתוף פעולה ראשוני על ניסויי optogenetic; BaljitKhakh, אריק הדסון, מייק Baca וג&#39;ון מיליגן (UCLA) לייעוץ טכני, ורוג&#39;ר צ&#39;היין (UCSD) לשף tdTomato לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי פרס NRSA (5F31NS064817) לAMSP ומענק של NSF (RIG: 0819010) ל-AS.

הכן הבא מבעוד מועד. 1. הכן כבלים אופטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת יחידת אחסון לכבל האופטי על ידי המסת הצוואר המחודד של זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן ליצור ~ 150 מעלות זווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

כבר תארנו את גישה להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים בדג הזברה RB חי. השיטה שלנו מעסיקה transgenesis החולף להביע גרסה מתויגת fluorescently channelrhodopsin, 13 השף tdTomato, בנוירונים חושיים ספציפיים. גישה זו יכולה בקלות להיות מותאמת לשימוש באוכלוסיות תאים אחרות זחל דג זברה. <p class="jove_content"...

פיתוח שיטות optogenetic לקידום או עיכוב רגישות עצבית באורכי גל מוגדר של אור אפשר ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות שונות של תאי עצב במעגלים עצביים השולטים 1 התנהגות, 19, 21. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות כדי להפעיל קבוצות של תאי עצב, אבל זה גם יכול לשמש כדי להפעיל נוירונים בודדים. זחלי דג זברה הם בעיקר נוחות לשיטות אלה מכיוון שהם שקופים, מערכת העצבים שלהם מתפתחת במהירות, ויצירת חיות טרנסגניות היא מהירה ושגרתי. עם זאת, מכשולים טכניים משמעותיים שיש להתגבר אמין כדי להשיג הפעלת תא עצב יחידה. כדי לייעל את ההליך להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים דג זברה, התמקדו בנוירונים חושיים. זחלי דג זברה לזהות מגוון של גירויים חושיים באמצעות שתי אוכלוסיות של תאי עצב: עצב trigeminal, אשר מעצבבות את הראש וRohon-זקן (הנוירונים) RB, אשר מעצבבים את שאר הגוף. כל trigeminal וRB נוירון מקרין האקסון היקפי שסניפים רבים בעור כדי לזהות גירויים והאקסון מרכזי המתחבר למעגלים עצביים במורד זרם. בעלי חיים להגיב למגע מוקדם ככל 21 שעות שלאחר ההפריה (hpf), המציין כי המעגלים החושיים קוהרנטית יצרו 5, 18. במהלך התפתחות רימות לפחות חלק סינפסה נוירונים trigeminal וRB על תא מאוטנר להפעיל תגובות בריחה קלסיות, אך מצטברת ראיות מצביעה על כך שיש כיתות מרובות של נוירונים חושיים עם דפוסים שונים של קישוריות שעשויה לעורר וריאציות על התנהגות הבריחה 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. המוטיבציה שלנו לפיתוח בשיטה זו הייתה לאפיין את התפקוד ההתנהגותי של סוגים שונים של תאי עצב חושיים, אך גישה זו יכולה בעיקרון לשמש כדי לחקור את הפונקציה של תא עצב או כל אוכלוסייה כמעט של הנוירונים בlarval דג זברה. דאגלס et al. תאר שיטה בעבר להפעלת Channelrhodopsin-2-לבטא נוירונים חושיים עם אור כחול, לעורר התנהגות בריחה 3. הגישה שלהם משמשת אלמנט משפר מגן isl1 לנהוג ביטוי של ChR2-EYFP בנוירונים חושיים. transgene זה, עם זאת, דווח להצגת פלואורסצנטי החלש יחסית, שדורש שיתוף הזרקה של כתב שני, כטב&quot;מ :: GFP, כדי לאפשר הדמיה של תאים לבטא ChR2-EYFP. גישה זו הייתה בשימוש כדי לעורר תגובות התנהגות בין 24-48 hpf, אבל אף פעם לא יכולה לעורר תגובת העבר 72 hpf. וכך, בעוד שיטה זו פועלת ללימוד מעגלים עצביים בשלבים מוקדמים מאוד זחל (24-48 hpf), אינו מתאים לאפיון מעגלים עצביים ותגובות התנהגותיות בזחלים מבוגרים יותר, כאשר תגובות התנהגותיות מגוונות יותר ניכרות והמעגלים עצביים הם יותר בוגרים. אנחנו בקשנולשפר את הרגישות של טכניקה זו כדי לאפיין את הפונקציה של אוכלוסיות של נוירונים RB זחל. כדי לשפר את הביטוי שהיינו משפר חושי ספציפי (CREST3) 20 לנהוג ביטוי של LexA-VP16 ומתיחה של רצפי מפעיל כסה (4xLexAop) 11 כדי להגביר את הביטוי של ערוץ האור המופעל מתויג fluorescently. תצורה זו מוגברת ביטוי של הערוץ, ומבטל את הצורך לביטוי שיתוף כתב שני ומאפשר לנו לקבוע באופן ישיר את השפע היחסי של הערוץ בכל נוירון. שימוש ברצף LexA / LexAop היה יתרון נוסף, מאפשר לנו להציג את transgene לתוך שורות כתב דג זברה שמשתמשות במערכת Gal4/UAS. ביטוי זמני של transgene זה הביא לרמות שונות של ביטוי, אך בדרך כלל היה חזק מספיק כדי להמחיש היא את גוף התא ותחזיות axonal של נוירונים בודדים על פני כמה ימים. כדי לייעל sensitivity להדליק השתמשנו באור הופעל ערוץ שף, גרסת channelrhodopsin מורכב דמיוני של channelopsin-1 (Chop1) וchannelopsin-2 (Chop2) עם אתר מוצלב בסליל לולאת EF 13. ערוץ זה מופעל באותו האורך הגל כChR2, אבל דורש עוצמת אור נמוכה יותר להפעלה, מה שהופך אותו רגיש יותר מערוצים אחרים בשימוש נפוץ, כולל ChR2. חלבון השף הותך לחלבון פלואורסצנטי האדום, tdTomato, ומאפשר לנו להקרין לביטוי חלבון ללא הפעלת הערוץ. כמקור אור, השתמש דיודה שאובה ליזר מצב מוצק (DPSS) מצמיד את כבל סיב אופטי, כדי לספק דופק מדויק ובעל עצמה של אור הכחול לאזור מסוים של הזחלים. זה מאפשר לנו למקד את אור ליזר על נוירונים בודדים, ומבטל את הצורך במציאת בעלי חיים מהונדסים נדירים המבטאים את הערוץ בתא עצב יחיד. שימוש בגישה זו, שהיינו מסוגל להפעיל נוירונים RB בודדים, להקליט תגובה התנהגותיתשל עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה, ותמונת הנוירונים מופעלים ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופיה confocal.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חומרים </td></tr><tr><td> זכוכית פיפטה פסטר </td><td> דיג </td><td> 1367820B </td><td> או שווה ערך (10-15 קוטר מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> 200 סיבים אופטיים מיקרומטר </td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> תיקון כבל, אורך: 3 מ &#39;, ניתוק: FC / PC, סוף B: FC / PC, ז&#39;קט: FT030 </td></tr><tr><td> 50 סיבים אופטיים מיקרומטר </td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> תיקון כבל, אורך: 3 מ &#39;, ניתוק: FC / PC, סוף B: FC / PC, ז&#39;קט: FT030 </td></tr><tr><td> כלי עקירה מתכוונן </td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td> או כלי עקירה שלוש חור (FTS4) </td></tr><tr><td> סופר יתד יהלומים </td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette פולר </td><td> סאטר מכשירים </td><td> P-97 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> צינורות זכוכית ורוסיליקט עם נימה </td><td> סאטר מכשירים </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> עובש הזרקה </td><td> n / </td><td> n / </td><td> איור 5 </td></tr><tr><td> 1.5 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי (100x15 מ&quot;מ) </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי (60x15 מ&quot;מ) </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> לחץ מזרק </td><td> אסי </td><td> MPPI-3 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Micromanipulator ומעמד מתכת </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> pipettes פלסטיק חד פעמי </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> פוקר (בעל פין וסיכת חרק) </td><td> פיין מדע הכלים, בע&quot;מ </td><td> 26018-17 ו26000-70 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> פיין מדע הכלים, בע&quot;מ </td><td> 11255-20 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Microloader פיפטה טיפים </td><td> אפנדורף </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5 מעלות צלזיוס חממה </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C בלוק חום </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> להבי אזמל ללא מעוקרים # 11 </td><td> כלים מדעיים פיין, Inc </td><td> 10011-00 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> ביתור שללהתמודד </td><td> Zeiss </td><td> STEMI </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> פלורסנט ביתור עם תקן סינון </td><td> כל </td><td> כל </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 או 710 </td><td> או שווי ערך עם לייזרים עבור ה-GFP וRFP, ו10x, 20x ו 40X יעדים </td></tr><tr><td> מצלמת מהירות גבוהה </td><td> AOS Technologies, Inc </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> 473 ננומטר ליזר נייד </td><td> לייזרי Crystal </td><td> CL-473-050 </td><td> או כוח עליון, עם אפשרות TTL </td></tr><tr><td> S48 ממריץ </td><td> Astro-Med, חלוקת מכשירי דשא בע&quot;מ </td><td> S48K </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> FC / PC לשרוול הזדווגות FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td> ne מאיאד לחיבור כבל אופטי </td></tr><tr><td> ליזר משקפי בטיחות </td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> 24 צלחות תרבות </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> שקופיות דיכאון יחידות </td><td> דיג </td><td> S175201 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> אוקיינוס ​​מיידי </td><td> מערכות אקולוגיות מימיות </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> כחול מתילן </td><td> דיג </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> סיגמא </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> נמוך הממסים agarose </td><td> סיגמא </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; או שווה ערך </td></tr><tr><td> PTU </td><td> סיגמא </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> סיגמא </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> מים כחולים / עובר </td><td></td><td></td><td> 10 הליטר DDH 2 O 0.6 גרם מיידי אוקיינוס 6 טיפין מתילן כחול </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td></td><td></td><td> (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.2 מ &#39;KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0.150 גרם PTU 50 המ&quot;ל DDH 2 O לפזר על 70 מעלות צלזיוס, לנער לעתים קרובות aliquot ולאחסן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 המ&quot;ל 100x PTU כחולים / דגי מים 99 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון Tricaine מניות </td><td></td><td></td><td> 400 מ&quot;ג tricaine 97.9 DDH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2.1 המ&quot;ל 1M טריס, pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; להתאים לחומציות ~ 7.0 חנות ב 4 ° C או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

דג זברת הזחל הם מתעוררים כמודל לתיאור ההתפתחות והתפקוד של מעגלים עצביים פשוטים. בשל ההפריה שלהם החיצוניות, ההתפתחות מהירה, והשקיפות, דג הזברה מתאים במיוחד גם לגישות optogenetic לחקור תפקוד מעגלים עצבי. בגישה זו, תעלות יונים רגישות לאור מבוטאות בתאי עצב מסוימים, ומאפשרים לניסוי כדי להפעיל או לעכב אותם ברצון ובכך להעריך את תרומתם להתנהגויות מסוימות. יישום שיטות אלו בדג זברת זחל הוא מושגית פשוט, אבל דורש אופטימיזציה של פרטים טכניים. כאן אנו מדגימים הליך לביטוי בגרסת channelrhodopsin נוירונים זחל דג זברה חושי, תאים בודדים מפעילות צילום, הקלטה ואת ההתנהגויות הנגזרות מכך. על ידי החדרה כמה שינויים לשיטות שנקבעו בעבר, גישה זו יכולה לשמש כדי לעורר תגובות התנהגותיות מתא עצב בודד הופעל עדללפחות 4 ימים לאחר ההפריה (DPF). באופן ספציפי, יצר transgene באמצעות חושי נוירון משפר, CREST3, לנהוג הביטוי מתויג channelrhodopsin הגרסה, שף tdTomato. הזרקת transgene זו לתוצאות עוברי שלב 1-תאים בביטוי פסיפס בנוירונים חושיים, שיכול להיות צלם עם מיקרוסקופיה confocal. מאיר זיהה תאים בבעלי חיים אלה עם אור ליזר DPSS ננומטר 473, מודרך דרך כבל סיב אופטי, מעורר התנהגויות שניתן להקליט במצלמת וידאו במהירות גבוהה ונותחו כמותית. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת להתנהגויות לימוד שהושרו על ידי הפעלה כל נוירון דג זברה. שילוב של גישה זו עם הפרעות גנטיות או תרופתיות יהיה דרך רבה עצמה כדי לחקור היווצרות מעגל ותפקודו.

<html><img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. כבל אופטי להגדיר. (A) שכבות של כבל סיב אופטי. (ב) כבל Stripped סיבים אופטי בפסטר פיפטה. (ג) כבל סיב אופטי בפיפטה פסטר מוצב באמצעות micromanipulator. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines (Video) | JoVE

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation (Video) | JoVE

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Optogenetic Functional MRI

MRI פונקציונלי optogenetic

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

פוטנציאל הקשור לאירוע החושית מעור Orofacial למתוח גירוי

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...