Name: optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00
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我々は、レーザーが設定挙動実験とDPSSについてのアドバイスをふみ久保トッドティエルとHerwigBaier校（UCSF /マックス·プランク研究所）に感謝、シェフtdTomato実験を補助するためのMBL神経生物学コースからHeesooキムとキアラCerri; PetronellaKettunen（ヨーテボリ大学）初期optogenetic実験のコラボレーションのために、BaljitKhakh、エリック·ハドソン、マイクバカと技術的なアドバイスのためにジョン·ミリガン校（UCLA）、そしてシェフtdTomato用ロジャーツィン校（UCSD）の構築。 ASへ：この作品はAMSPとNSFからの助成金にNRSA（5F31NS064817）賞（0819010 RIG）によってサポートされていました。

前もって次の準備をします。 1。ファイバケーブルを準備<ol><li> 〜150°の角度を作成するにはブンゼンバーナーの上にガラスパスツールピペットのテーパー首を溶融することによって光ファイバケーブル用のストレージユニットを作成します。 </li><li>ワイヤカッターまたはカミソリの刃を使用して、慎重に二つにファイバーケーブルを切断してください。それぞれの作?...

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. 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Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

我々は、ゼブラフィッシュのライブで単一のRBニューロンのoptogenetic活性化するためのアプローチを説明してきました。我々の方法は、特定の体性感覚ニューロンに蛍光標識channelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomato 13を発現する一過性遺伝子導入を採用しています。このアプローチは、簡単に他の幼虫のゼブラフィッシュの細胞集団での使用に適合させることができた。 <p class="jove_conten...

光の波長と定義されている神経細胞の興奮性を促進または阻害するためoptogenetic方法の開発は、それが可能な行動1、19、21を制御する神経回路のニューロンの異なる集団の機能を研究するために作られました。この技法はしばしばニューロンのグループをアクティブにするために使用されますが、それはまた、個々の神経細胞を活性化するために使用することができます。彼らは半透明であるため、ゼブラフィッシュの幼虫はこれらの方法に特に適している、彼らの神経系はすぐに開発し、トランスジェニック動物を作成することは、迅速かつルーチンです。しかし、重要な技術的ハードルは確実に単一ニューロンの活性化を実現するために克服しなければならない。 シングルゼブラニューロンのoptogenetic活性化のための手順を最適化するために、私たちは体性感覚ニューロンに焦点を当てた。頭を支配する三叉神経ニューロン、およびRohon·ビアード（：ゼブラフィッシュの幼虫は、2つのニューロンの集団を用いて体性感覚刺激の様々な検出RB）の本体の残りの部分を支配するニューロン。各三叉とRBニューロンは皮膚の広範囲に枝が刺激と下流の神経回路に接続する中央の軸索を検出するために末梢軸索を投射する。動物は、コヒーレント性感覚回路5、18を形成していることを示す、21時間後の受精（HPF）には早くもタッチに反応。幼虫の発育中に少なくともマウスナー細胞上にいくつかの三叉神経とRBニューロンのシナプスは、古典的なエスケープ応答を活性化しますが、エビデンスが蓄積され逃避行動2、4のバリエーションを引き出すことができる接続のさまざまなパターンを持つ体性感覚ニューロンの複数のクラスがあることを示唆する10、12、14、15、16、17。この方法を開発するための私たちの動機は、体性感覚ニューロンの異なるクラスの行動機能を特徴づけることであったが、この方法は、原理的にはLARのニューロンのほぼすべてのニューロンまたは人口の機能を研究するために使用することができるvalのゼブラフィッシュ。 ダグラスらは、以前に逃避行動を誘発する3、青色光チャネルロドプシン-2発現性感覚ニューロンを活性化するための方法を記載した。彼らのアプローチは、体性感覚ニューロンでChR2-EYFPの発現を駆動するためにISL1遺伝子からエンハンサー要素を使用していました。この導入遺伝子は、しかし、ChR2-EYFPを発現する細胞の可視化を可能にするために第二のレポーター、UAS :: GFPの同時注入を必要とする、比較的弱い蛍光を表示することが報告された。このアプローチは、24から48の間にHPF行動応答を誘発するために使用されましたが、72 HPF過去の応答を引き出すことができませんでした。この方法は非常に早い幼生期（24〜48 HPF）で神経回路を研究するために動作しつつ、それは、より多様な行動反応は明らかであり、神経回路は、より成熟している年上の幼虫の神経回路と行動反応を特徴づけるには不十分である。 我々はしようとした幼虫のRBのニューロンの亜集団の機能を特徴付けるために、この技術の感度を向上させる。発現を改善するために我々は蛍光標識された光によって活性化されたチャネルの発現を増幅するためのLexA-VP16とのLexAオペレーター配列のストレッチ（4xLexAop）11の発現を駆動するために体性感覚的エンハンサー（CREST3）20を使用していました 。この構成では、第二のレポーターを共発現し、私たちは直接、各ニューロンのチャンネルの相対量を判断できるようにすることの必要性を排除し、チャネルの発現を増幅した。のLexA / LexAopシーケンスを使用することで、Gal4/UASシステムを使用してゼブラフィッシュレポーターラインに導入遺伝子を導入することを可能にするという付加的な利点を持っていた。この導入遺伝子の一過性発現は、発現のレベルを変化させた結果が、通常は数日間にわたって細胞体および個々のニューロンの軸索突起の両方を視覚化することは十分に堅調に推移しました。感度を最適化するには明るみにITY我々はチャネルシェフ、ヘリックスループEF 13でクロスサイトのchannelopsin-1（Chop1）とchannelopsin-2（CHOP2）のキメラから成るchannelrhodopsin変異体を活性化する光を使用していました。このチャネルは、ChR2と同じ波長で活性化しますが、ChR2を含む他の一般的に使用されるチャネル、よりそれがより敏感になるため、活性化のためのより低い光強度を必要としている。シェフのタンパク質は、私たちがチャネルをアクティブにせずにタンパク質の発現をスクリーニングできるように、赤色蛍光タンパク質、tdTomatoに融合させた。光源として、我々はダイオードが幼虫の特定の領域に青色光の正確な、ハイパワーパルスを供給するように、光ファイバケーブルに結合固体（DPSS）レーザ励起に使用。これは、私たちは単一ニューロンにおけるチャネルを発現している稀なトランスジェニック動物を見つけるための必要性を排除し、個々のニューロンにレーザ光の焦点を合わせることができました。このアプローチを使用して、我々は、単一のRBのニューロンを活性化する行動反応を記録することができました高速度ビデオカメラ、および画像共焦点顕微鏡による高分解能で活性化されたニューロンの。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 材料 </td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 1367820B </td><td>または同等の（10-15 mm径） </td></tr><tr><td> 200μmの光ファイバー</td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td>パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030 </td></tr><tr><td> 50μmの光ファイバ</td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td>パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030 </td></tr><tr><td>調節可能なストリッピングツール</td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td>または3ホールストリッピングツール（FTS4） </td></tr><tr><td>ダイヤモンドウェッジスクライブ</td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-97 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>フィラメントとホウケイ酸ガラスチューブ</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF-100-78から10 </td><td></td></tr><tr><td>射出成形金型</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>図5 </td></tr><tr><td> 1.5 mlの遠心管</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（100x15 mm）の</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（60x15 mm）の</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>圧力インジェクタ</td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マニピュレーターと金属スタンド</td><td>持てる</td><td> M152 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>使い捨てのプラスチックピペット</td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ポーカー（ピンホルダーと昆虫ピン） </td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 26018から17と26000から70 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 11255から20 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> Microloaderピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5℃のインキュベーター</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td> 42℃のヒートブロック</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌メスブレード＃11 </td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 10011から00 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> sを解剖対処</td><td>ツァイス</td><td> STEMI </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>標準フィルタと蛍光解剖スコープ</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSMは510または710 </td><td>またはGFPおよびRFP、及び10倍、20倍と40倍の目標を達成するためのレーザーと同等の</td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドカメラ</td><td> AOSテクノロジーズ株式会社</td><td> X-PRI（130025から10） </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> 473 nmのポータブルレーザー</td><td>結晶レーザー</td><td> CL-473から050 </td><td> TTLオプション付きまたは高電力、 </td></tr><tr><td> S48スティミュレータ</td><td>アストロメッド株式会社草音源部門</td><td> S48K </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> FC / FC / PC交配スリーブへのPC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td>月ねファイバケーブルの接続を行うために、ed </td></tr><tr><td>レーザー安全メガネ</td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> 24培養プレート</td><td>ジェネシー川</td><td> 25から102 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>シングルうつ病スライド</td><td>フィッシャー</td><td> S175201 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>インスタント海</td><td>水生生態系</td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>フィッシャー</td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>シグマ</td><td> A9045 </td> &lt;TD&gt;または同等</td></tr><tr><td> PTU </td><td>シグマ</td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td>シグマ</td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td>青/胚水</td><td></td><td></td><td> 10Lの蒸留H 2 O 0.6グラムインスタントオーシャン 6滴メチレンブルー</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td></td><td></td><td> （0.2MのKCl、5 mg / ml）を</td></tr><tr><td> 100xのPTU </td><td></td><td></td><td> 0.150グラムPTU 50ミリリットルddH 2 Oを 70で溶解℃、頻繁に振る -20℃でアリコートとストア</td></tr><tr><td> 1X PTU </td><td></td><td></td><td> 1ミリリットル100xのPTU 99ミリリットル/青魚の水</td></tr><tr><td> Tricaine原液</td><td></td><td></td><td> 400mgのtricaine 97.9 ddH 2 Oを</td></tr><tr><td> 〜2.1ミリリットル1Mトリス、pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;TD&gt;〜pHを7.0に調整 長期保存のため4℃または-20℃に保管して</td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

ゼブラフィッシュ幼生は単純な神経回路の発達と機能を記述するためのモデルとして浮上している。彼らの体外受精、急速な発展、および透明度のために、ゼブラフィッシュは、特に神経回路機能を調べるためにoptogeneticのアプローチに適しています。このアプローチでは、光感受性イオンチャネルを活性化または阻害するそれらの意志で、したがって、特定の行動への貢献を評価するための実験を​​可能にし、特定の神経細胞で発現されています。幼虫のゼブラフィッシュでこれらの方法を適用することは、概念的には単純ですが、技術的な詳細の最適化が必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ幼生体性感覚ニューロン、写真活性化単一細胞でchannelrhodopsin変異体を発現させ、その結果の行動を記録するための手順を示しています。以前に確立された方法にいくつかの変更を導入することによって、このアプローチは、最大活性化する単一ニューロンから行動応答を誘発するために使用することができる少なくとも4日後に受精（DPF）へ。具体的には、タグ付けされたchannelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomatoの発現を駆動するために体性感覚ニューロンエンハンサー、CREST3を使用して導入遺伝子を作成しました。共焦点顕微鏡で画像化することができる体性感覚ニューロンにおけるモザイク式、1細胞期胚の結果にこの導入遺伝子を注入する。照明は、光ファイバケーブルを介して導かれ、473 nmのDPSSレーザーからの光を用いて、これらの動物で細胞を同定し、高速度ビデオカメラで記録し、定量的に分析することができる行動を誘発する。この手法は、任意のゼブラフィッシュの神経細胞を活性化することによって誘発行動を研究するために適合させることができた。遺伝的または薬理学的摂動にこのアプローチを組み合わせることで、回路形成と機能を調べるための強力な手段となります。

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。ファイバケーブルは、設置した。光ファイバケーブルの（A）のレイヤー。パスツールピペット（B）中の剥奪光ファイバケーブル。 （C）をパスツールピペットでの光ファイバケーブルは、マイクロマニピュレーターを使用して配置。 <img src="/files...

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato Video (Video) | JoVE

Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。

CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines Video (Video) | JoVE

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation Video (Video) | JoVE

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Optogenetic Functional MRI

光遺伝学機能MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

口腔顔面皮膚ストレッチ刺激から体性感覚事象関連電位

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

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ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

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