Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Vi takker Dr. Charles Greenberg for brugen af ​​hans Real time PCR maskine. Dette arbejde understøttes af Musc Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103.780-01A1, og NIH 3P30CA138313-01S3. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health eller andre finansieringskilder midler.

1. Bone Marrow Cell Isolation <ol><li> Aflive mandlige donorer FVB / NJ mus og kvindelige FVB / NJ mus ved hjælp af CO2 metode efterfulgt af cervikal dislokation. De kvindelige FVB / NJ knoglemarvsceller vil blive brugt som kompetitive celler. </li><li> Brug en lille saks og pincet, dissekere ud lårben og tibiaes fra mus og placere dem i en 60 mm vævsdyrkningsskål indeholdende 6 ml iskold RPMI1640 med 5% varmeinaktiveret FBS. Brug Kimwipe væv at fjerne muskler og andre væv. Afbrød begge ender af hver...

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

Formålet med vores nuværende undersøgelse er at give publikum en PCR-baseret teknik til at kvantificere donorcelle indpodning i et konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation model. Adskillige undersøgelser er blevet rapporteret under anvendelse af RT-PCR til påvisning af donorceller i transplantation modeller 9-10. Dr. Schwarzenberger gruppe først udviklede en murin knoglemarvstransplantation model ved hjælp af real-time PCR til amplifikation y-kromosom-specifik 8. Denne metode blev...

Murin knoglemarv (BM) transplantation model blev først udviklet i 1960&#39;erne 1. Denne model er blevet omfattende anvendt til undersøgelse af donor hæmatopoietisk stamcelle (HSC) biologi i en vært recipient mus. Murin knoglemarvstransplantation model har givet os værdifuld viden om HSC funktioner og deres regulering, og er uundværlig i HSC forskning. Allogen knoglemarvstransplantation model som C57BL/6J H2b-Balb / C H2d eller kongene transplantation model som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 anvendes i mange laboratorier for at studere genfunktion på HSC aktivitet 2, virkningen af lægemiddelbehandling på HSC funktion 3 eller transplantation sygdomme, såsom graft-versus-vært sygdom (GVHD) 4. Celleoverflademarkører, såsom MHC haplotype eller CD45.1 er almindeligt anvendt til at skelne mellem donor-afledte celler fra recipient-stammer celler. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup&gt;, Balb / C H2d og B6.SJL CD45.1 er de mest almindeligt anvendte musestammer i knoglemarvstransplantation, fordi donorcellen bidrag kan let vurderes ved flow-cytometri måling CD45.1 mod CD45.2 eller H2b vs H2d. Men mange andre stammer, såsom FVB / NJ 5 og C3H også ofte til at generere genetisk manipuleret transgene eller knockout-mus. Disse mus kan tilbagekrydset til en indavlet linie og holdes i en blandet genetisk / MHC baggrund. I disse tilfælde kunne bestemme donorcelle engraftment og HSC funktionen være vanskeligt som donor specifik-celleoverflademarkører ikke kan være til rådighed. Ved hjælp af Y-kromosom-specifik DNA-probe til påvisning donor mandlige celler ved Southern blot i sex-mismatchede knoglemarvstransplantation blev først udviklet af Dr. Miwa gruppe 6. Derefter blev en real-time PCR for sex-bestemmende region Y sig at være en nøjagtig og yderst specifik metode til kvantificering af male føtale celler i moderblod system 7. Dette koncept blev tilpasset af Dr. Schwarzenberger gruppe for udvikling af en real-time PCR teknik i et murint knoglemarvstransplantation til bestemmelse donorcelle engraftment 8. Vi yderligere modificeret denne metode til måling af donorcellen indpodning i FVB / NJ mus knoglemarvstransplantation model. Denne metode er i øjeblikket udstrakt grad i vores gruppe for at studere den rolle Pim1 kinase i HSC biologi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfrit) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Varmeinaktiveret </td></tr><tr><td> Ammoniumchlorid </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194.806 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumhydrogencarbonat </td><td> Fisher </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA Blood minisæt </td><td> Qiagen </td><td> 51.106 </td><td></td></tr><tr><td> Cell si </td><td> BD bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 real time PCR maskine </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotometer </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

Murine knoglemarvstransplantation modeller giver et vigtigt redskab til måling af hæmatopoietiske stamceller (HSC) funktioner og bestemme gener / molekyler, der regulerer HSCs. I disse transplanterede modelsystemer, er funktionen af ​​HSCs bestemt ved evnen af ​​disse celler til indpode og rekonstituere letalt bestrålede recipientmus. Almindeligvis donorcellen bidrag / engraftment målt ved antistoffer mod donor-specifikke celleoverfladeproteiner ved anvendelse af flowcytometri. Men denne metode afhænger i høj grad af specificitet og evnen af ​​celleoverflademarkør at differentiere donor-afledte celler fra recipient-stammer celler, som måske ikke er tilgængelige for alle musestammer. Blandt de forskellige baggrunde af genetisk modificerede musestammer på markedet, denne celleoverfladen / flowcytometri-baseret metode har væsentlige begrænsninger især i musestammer, som mangler veldefinerede overflademarkører at adskille donorceller fra congene recipient ceLLS. Her vi rapporteret en PCR-baseret teknik til at bestemme donorcelle engraftment / bidrag transplantation recipientmus. Vi transplanteret mandlige donorknoglemarv HSCs til letalt bestrålede kongene hunmus. Perifere blodprøver blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transplantation. Knoglemarvsprøver blev opnået ved afslutningen af ​​forsøgene. Genomisk DNA blev isoleret og Y-kromosomet specifikt gen, Zfy1, blev amplificeret ved brug af kvantitativ real time PCR. Den indpodning af mandlige donor-afledte celler i de kvindelige recipientmus blev beregnet mod standardkurve med kendte procentdel af mandlige vs kvindelige DNA&#39;er. Bcl2 blev anvendt som reference-gen at normalisere den totale DNA beløb. Vore data tydede på, at denne fremgangsmåde pålideligt bestemmer donorcelle engraftment og giver en nyttig, men enkel fremgangsmåde til måling af hæmatopoietisk celle rekonstituering i murine knoglemarvstransplantation modeller. Vores metode kan rutinemæssigt udføres i de fleste laboratorier, da ingendyrt udstyr, såsom flowcytometri er påkrævet.

Figur 1 og 2 viste eksempler på standardkurver afbildet med middelværdier af 2-δCt mod procentdele af mandlig DNA. Figur 1A viste specifikke smeltetemperatur for BCL2 og Zfy1 amplikoner lokaliseret ved 78,5 ° C og 88,5 ° C, hhv. Bcl2 anvendes som reference-gen at normalisere den totale mængde belastet DNA i hver PCR-reaktion. Bcl2 amplifikations kurver (Log view) for hver standard prøve fusionere med hinanden uafhængig af mandlig DNA-koncentration, hvilket indikerer s...

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bestemmelse donorcelle engraftment er en udfordring i mus knoglemarvstransplanterede modeller, der mangler veldefinerede fænotypiske markører. Vi beskrev en metode til at kvantificere mandlig donorcelle indpodning hos kvindelige transplantation recipientmus. Denne metode kan anvendes i alle musestammer til studiet af HSC funktioner.

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere for Behandling af akut leukæmi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Muse Livmoderhalskræft Heart transplantation model ved hjælp af en modificeret Cuff Teknik

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Et tredimensionalt Tissue Culture Model til Study Primary human knoglemarv og dens Maligne

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murin hornhindetransplantation: en model til at studere den mest almindelige form for organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluering af lungemetastase i musebrysttumor modeller af kvantitativ real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Generation af lukkede femur frakturer i mus: en Model til at studere knogleheling

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...