Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר צ&#39;רלס גרינברג לשימוש במכשיר ה-PCR בזמן האמת שלו. עבודה זו נתמכת על ידי מרכז לחקר סרטן MUSC הולינגס הפעלת קרן, הולינגס מרכז הסרטן ACS IRG, ASCO Conquer פרס פיתוח קריירת קרן הסרטן, NIH 1K08HL 103780-01A1, וNIH 3P30CA138313-01S3. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות או סוכני מימון אחרים.

1. בידוד תאי מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים תורמים עכברי FVB / ניו ג&#39;רזי ועכברים ממין נקבת FVB / ניו ג&#39;רזי באמצעות שיטת 2 CO ואחרי עקירת צוואר רחם זכרים. התאים הנקביים FVB / ניו ג&#39;רזי מח העצם ישמשו כתאים תחרותיים. </li><li style=";text-align:right;dire...

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

מטרת המחקר הנוכחי שלנו היא לספק לקהל טכניקה מבוססת PCR לכמת engraftment תא התורם במודל תחרותי עכברי מח עצם השתלה. מספר מחקרים שדיווחו על השימוש בRT-PCR לזיהוי תאי תורם במודלי השתלה 9-10. קבוצתו של ד&quot;ר Schwarzenberger פותחה לראשונה מודל עכברי השתלת מח עצם באמצעות PCR בזמן אמת כדי ל...

מודל Murine מח עצם (BM) השתלה פותח לראשונה ב -1960 1. דגם זה כבר נעשה שימוש נרחב לחקר התא תורם גזע hematopoietic (HSC) בביולוגית עכבר נמען מארח. מודל השתלת מח העצם Murine ספק לנו ידע רב ערך על פונקציות HSC והרגולציה שלהם והכרחי במחקר HSC. מודל allogeneic השתלת מח עצם כמו C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d או מודל ההשתלה congenic כמו C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 משמש במעבדות רבות כדי ללמוד את תפקוד הגן על פעילות HSC 2, השפעה של טיפול תרופתי על תפקוד 3 או השתלת HSC מחלות נלוות כגון מחלת שתל נגד מארח (GVHD) 4. סמנים בתא שטח כגון haplotype MHC או CD45.1 משמשים בדרך כלל לתאים מייחדים תורם הנגזרים מתאי נמען מקורם-. C57Bl/6J H2B, CD45.2 </sup&gt;, BALB / C H2d וB6.SJL CD45.1 הם זני העכבר הנפוץ ביותר בהשתלת מח עצם, כי תרומת התא התורם ניתן להעריך בקלות על ידי הזרימה cytometry מדידת CD45.1 לעומת CD45.2 או H2B לעומת H2d. עם זאת, זנים רבים אחרים, כגון FVB / ניו ג&#39;רזי 5 ו C3H הם גם משמשים לעתים קרובות כדי לייצר מהונדסים בהנדסה גנטית או עכברים בנוקאאוט. עכברים אלו ניתן backcrossed לקו לדה ומתוחזק ברקע מעורב גנטי / MHC. במקרים אלה, קביעת engraftment תא תורם ותפקוד HSC יכולה להיות קשה כסמני שטח ספציפיים בתאים תורמים לא יהיו זמינים. באמצעות בדיקת כרומוזום Y-DNA ספציפית כדי לזהות את תאי תורם גברים על ידי כתם דרומי בהשתלת מח עצם מין חוסר התאמה שפותח לראשונה על ידי הקבוצה של ד&quot;ר Miwa 6. ואז, PCR בזמן אמת לקביעת מין האזור Y-נמצא שיטה מדויקת וספציפית מאוד לכמת maתאים עובריים le במערכת הדם האם 7. רעיון זה אומץ על ידי קבוצתו של ד&quot;ר Schwarzenberger לפיתוח של טכניקה בזמן אמת PCR במודל עכברי השתלת מח עצם כדי לקבוע engraftment התא התורם 8. אנחנו שונים בשיטה זו נוספת למדידת engraftment תא התורם במודל FVB / ניו ג&#39;רזי עכבר השתלת מח עצם. שיטה זו כיום שימוש נרחב בקבוצה שלנו ללימוד התפקיד של Pim1 קינאז בביולוגית HSC.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> חום מומת </td></tr><tr><td> אמוניום כלוריד </td><td> חבר הפרלמנט Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> יקרבונט אשלגן </td><td> דיג </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA הדם MINIKIT </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא </td><td> BD מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR הירוק supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR בזמן אמת iQ5 </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ספקטרה פוטומטר </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

מודלי השתלת מח עצם Murine לספק כלי חשוב במדידה סלולרית פונקציות hematopoietic גזע (HSC) וגנים הקובעים / מולקולות המווסתות HSCs. במערכות מודל השתלות אלה, הפונקציה של HSCs נקבעת על ידי היכולת של תאים אלה נקלטים ולגבש מחדש עכברי נמען קטלני מוקרנים. בדרך כלל, התרומה / engraftment התא התורם נמדד על ידי נוגדנים לחלבונים בתא שטח תורם ספציפי באמצעות cytometry זרימה. עם זאת, שיטה זו תלויה במידה רבה על הספציפיות ואת יכולתו של סמן תא השטח כדי לבדל תאי תורם המופקים מתאי נמען מקורם-, אשר עשוי שלא להיות זמין עבור כל הזנים של העכברים. בהתחשב ברקע השונה של זני עכבר מהונדס גנטי בשוק, משטח זה תא / זרימת cytometry שיטה מבוססת יש מגבלות משמעותיות במיוחד בזני עכברים שאין סמנים מוגדרים היטב על פני שטח לתורם בתאים נפרדים מcongenic הנמען ceLLS. כאן, אנו מדווחים טכניקת PCR מבוססת כדי לקבוע engraftment / תרומת התא התורם בעכברי השתלה. אנו הושתלנו HSCs מח עצם התורם גברים לנקבות העכברים congenic קטלני מוקרנים. דגימות דם היקפיות נאספו בהשתלת הודעה שונה נקודתי זמן. דגימות מח עצם התקבלו בתום הניסויים. הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד וגן כרומוזום Y הספציפי, Zfy1, הוגבר שימוש בזמן אמת PCR כמותית. Engraftment של תאים זכריים תורם המופקים בעכברי הנמען הנשים חושב על עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של גברי DNAs לעומת נקבה. Bcl2 שמש גן התייחסות לנרמל את כמות הדנ&quot;א המוחלטת. הנתונים שלנו הציעו כי גישה זו אמינה קובעת engraftment תא התורם ומספקת שיטה יעילה, פשוטה אך במדידת הכינון מחדש של תאי hematopoietic במודלים של השתלת מח עצם Murine. השיטה שלנו יכולה להיות מבוצעת באופן שגרתי ברוב המעבדות כי אףציוד יקר כגון cytometry זרימה נדרש.

איור 1 ו 2 הראו דוגמאות לעקומות סטנדרטיות זממו עם ערכים ממוצעים של 2-δCt נגד אחוזי DNA הגברי. האיור 1A הראה טמפרטורת התכה ספציפית לBcl2 וZfy1 amplicons מותאם ב78.5 המעלות צלזיוס ו88.5 ° C, בהתאמה. Bcl2 משמש כגן התייחסות לנרמל את הסכום הכולל של ה-DNA הטעון בכל תגובת PCR....

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

עכברי צוואר הרחם לב השתלת דגם שימוש בטכניקת חפתים השתנה

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

באתרו לשעבר Normothermic מכונת זלוף של כבדים תורמים

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

הדור של שברי הירך סגור בעכברים: מודל ללמוד ריפוי עצם

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...