Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Ringraziamo il Dott. Carlo Greenberg per l&#39;uso della sua macchina in tempo reale PCR. Questo lavoro è supportato da MUSC Hollings Cancer Center di avvio del fondo, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Premio alla Carriera della Fondazione per lo sviluppo, NIH 1K08HL 103780-01A1, e NIH 3P30CA138313-01S3. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o agenti di finanziamento.

1. Midollo osseo di isolamento cellulare <ol><li> Eutanasia maschi donatori FVB / NJ topi e femmine FVB / NJ topi utilizzando CO 2 metodo seguito da dislocazione cervicale. Le femmine FVB / NJ cellule di midollo osseo saranno utilizzate come cellule competitivi. </li><li> Utilizzare piccole forbici e pinze, sezionare femore e tibiaes da topi e metterli in un piatto 60 millimetri tessuto di coltura contenente 6 ml ghiacciata RPMI1640 con FBS di calore 5% inattivato. Usare tessuti Kimwipe per rimuovere muscol...

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

L&#39;obiettivo del nostro studio è quello di fornire il pubblico una tecnica PCR per quantificare l&#39;attecchimento delle cellule del donatore in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo. Diversi studi sono stati riportati con RT-PCR per rilevare le cellule del donatore in modelli di trapianto 9-10. Gruppo del Dr. Schwarzenberger primo sviluppato un modello murino di midollo osseo trapianto con real-time PCR per amplificare y-cromosoma-specifici 8. Questo metodo è stato utilizz...

Murine midollo osseo (BM) trapianto di modello è stato sviluppato nel 1960 1. Questo modello è stato ampiamente utilizzato per lo studio di cellule staminali ematopoietiche del donatore (HSC) biologia in un mouse destinatario host. Murine midollo osseo trapianto di modello ci ha fornito preziose conoscenze sulle funzioni HSC e la loro regolazione ed è indispensabile nella ricerca HSC. Trapianto allogenico di midollo osseo trapianto di modello come C57BL/6J H2b-Balb / C H2D o modello trapianto congenic come C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 sono utilizzati in molti laboratori per studiare la funzione dei geni sull&#39;attività HSC 2, effetto di trattamento farmacologico di patologie HSC funzione 3 o il trapianto correlati, come graft-versus-host disease (GvHD) 4. Marcatori cellulari di superficie come aplotipo MHC o CD45.1 sono comunemente usati per distinguere i donatori cellule derivate da cellule destinatario-origine. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup&gt;, Balb / C e H2D B6.SJL CD45.1 sono i ceppi di topi più comunemente utilizzate nel trapianto di midollo osseo in quanto il contributo cellula donatrice può essere facilmente valutata mediante citometria a flusso misurando CD45.1 vs CD45.2 o H2b vs H2D. Tuttavia, molti altri ceppi come FVB / NJ 5 e C3H sono spesso utilizzati per generare transgenici o geneticamente topi knockout. Questi topi possono essere re-incrociata a una linea inbred e mantenuto in un ambiente misto genetico / MHC sfondo. In questi casi, la determinazione delle cellule attecchimento donatore e funzione HSC potrebbe essere difficile da donatori specifici marcatori di superficie delle cellule può non essere disponibile. Utilizzando Y-cromosoma-specifici test sul DNA per individuare le cellule del donatore di sesso maschile con macchia meridionale sesso non corrispondenti trapianto di midollo osseo è stato sviluppato dal gruppo del Dr. Miwa 6. Poi, una real-time PCR per l&#39;determina il sesso Y regione è risultato essere un metodo accurato ed altamente specifico per quantificare maLe cellule fetali nel sangue materno sistema 7. Questo concetto è stato adattato da Dr. Schwarzenberger gruppo per lo sviluppo di una real-time PCR in un modello murino di trapianto di midollo osseo per determinare cellula donatrice attecchimento 8. Abbiamo ulteriormente modificato questo metodo per la misura di attecchimento delle cellule del donatore in FVB / NJ modello trapianto di midollo osseo del mouse. Questo metodo è attualmente ampiamente utilizzata nel nostro gruppo per studiare il ruolo della chinasi PIM1 in biologia HSC.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Inattivato al calore </td></tr><tr><td> Cloruro di ammonio </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di potassio </td><td> Pescatore </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA sangue minikit </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Cella filtro </td><td> Bioscienze BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 real time PCR macchina </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotometro </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

Murini osseo modelli di trapianto di midollo fornire un importante strumento per la misurazione di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni e geni che determinano / molecole che regolano la CSE. In questi sistemi modello di trapianto, la funzione di CSE è determinato dalla capacità di queste cellule di topi riceventi attecchire e ricostituire letalmente irradiati. Comunemente, la cellula donatrice contributo / attecchimento si misura con gli anticorpi alle proteine ​​delle cellule del donatore-specifici di superficie in citometria a flusso. Tuttavia, questo metodo dipende fortemente la specificità e la capacità del marcatore di superficie cellulare per differenziare donatore cellule derivate da cellule destinatario-origine, che possono non essere disponibili per tutti i ceppi di topo. Considerando i vari ambiti di provenienza di ceppi di topi geneticamente modificati sul mercato, questa superficie delle cellule / citometria a flusso a base di metodo presenta limitazioni significative soprattutto in ceppi di topi che mancano ben definiti marcatori di superficie di cellule del donatore separate da congenic destinatario ceLLS. Qui, abbiamo riportato un PCR-based tecnica per determinare l&#39;attecchimento delle cellule del donatore / contributo in topi riceventi di trapianto. Abbiamo trapiantato maschi donatori cellule staminali emopoietiche del midollo osseo di topi irradiati letalmente congenici femminili. Campioni di sangue periferico sono stati raccolti in diversi tempi post-trapianto punti. Campioni di midollo osseo sono stati ottenuti al termine degli esperimenti. DNA genomico è stato isolato e il gene cromosoma Y specifico Zfy1, è stato amplificato mediante PCR quantitativa in tempo reale. L&#39;attecchimento dei maschi donatori cellule derivate nei topi riceventi femminili è stato calcolato contro curva standard con percentuale nota di DNA maschile vs femminile. Bcl2 è stato usato come un gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA. I nostri dati suggeriscono che questo approccio determina affidabile attecchimento delle cellule del donatore e fornisce un metodo utile, ma semplice per misurare la ricostituzione delle cellule ematopoietiche in modelli murini di trapianto di midollo osseo. Il nostro metodo può essere eseguita di routine nella maggior parte dei laboratori perché noapparecchiature costose quali citometria di flusso è necessario.

Figura 1 e 2 mostrato esempi di curve standard tracciate con valori medi di 2-ACT contro percentuali di DNA maschile. Figura 1A mostrato specifica temperatura di fusione per Bcl2 e Zfy1 ampliconi localizzati a 78,5 ° C e 88,5 ° C, rispettivamente. Bcl2 è utilizzato come gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA caricato in ciascuna reazione PCR. Bcl2 curve di amplificazione (vedi Log) per ciascun campione standard fondersi tra loro indipendente dalla ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Determinare l&#39;attecchimento delle cellule del donatore rappresenta una sfida in modelli di trapianto di midollo osseo di topo che non hanno ben definiti marcatori fenotipici. Abbiamo descritto una metodologia per quantificare maschio attecchimento delle cellule del donatore nel topo femmina riceventi di trapianto. Questo metodo può essere utilizzato in tutti i ceppi di topo per lo studio delle funzioni HSC.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Ricerca

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murino cervicale Cuore trapianto Modello utilizzando una tecnica Cuff Modificato

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murini trapianto di cornea: Un modello per studiare la forma più comune di trapianto di organi solidi

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...