Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

我々は彼のリアルタイムPCR装置の使用のために博士チャールズグリーンバーグに感謝します。この作品は、MUSCホリングズがんセンタースタートアップファンド、ホリングズがんセンターACS IRG、ASCOのがん財団のキャリア開発賞を征服し、NIH 1K08HL 103780-01A1、およびNIH 3P30CA138313-01S3でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所（NIH）やその他の資金調達エージェントの公式見解を示すものではありません。

1。骨髄細胞の単離<ol><li>男性ドナーFVB / NJマウスや頸椎脱臼続いたCO 2の方法を使用して女性のFVB / NJマウスを安楽死させる。女性FVB / NJ骨髄細胞は、競争力のある細胞として使用されます。 </li><li>マウスからの大腿骨およびtibiaesをばらばらにすると5％の熱不活性化FBSを6 mlの氷冷した1640を含む60mmの組織培養皿に置き、小さなはさみや鉗子を使用しています。筋肉や他の組織を除去?...

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	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

我々の現在の研究の目的は、観客に競争力のあるマウス骨髄移植モデルのドナー細胞の生着を​​定量化するためのPCRベースの技術を提供することにある。いくつかの研究は移植モデル9-10にドナー細胞を検出するためにRT-PCRを用いて報告されている。博士シュワルツェンバーガーのグループは、最初のY染色体に特異的な8を増幅するリアルタイムPCRを用いてマウス骨髄移植モ...

マウス骨髄（BM）移植モデルは、1960年代に最初1で開発されました。このモデルは広範囲にホストレシピエントマウスにおけるドナーの造血幹細胞（HSC）の生物学の研究に用いられてきた。マウス骨髄移植モデルは、HSCの機能とその調節に関する貴重な知識を提供してくれましたし、HSCの研究に不可欠である。 C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1様C57BL/6J H2B-のBalb / C H2Dまたはジェニック移植モデルのような同種骨髄移植モデルでは、効果の、HSCの活性が2日に遺伝子機能を研究するために多くの研究室で使用されているそのような移植片対宿主病（GVHD）4などのHSC機能3または移植関連疾患に対する薬物治療。 そのようなMHCハプロタイプまたはCD45.1として細胞表面マーカーは、一般的に受信者から発信された細胞から区別するドナー由来細胞に使用されます。 C57BL/6J H2B、CD45.2 </suドナー細胞の寄与を簡単CD45.1 対 CD45.2またはH2B対を測定するフローサイトメトリーにより評価することができるので、p&gt;は、BALB / C H2DとB6.SJL CD45.1は、骨髄移植で最も一般的に使用されるマウス株であるH2D。しかし、このようなFVB / NJ 5とC3Hのような他の多くの菌株もしばしば遺伝子組み換えトランスジェニックやノックアウトマウスを生成するために使用されます。これらのマウスは近交系に戻し交配および混合MHC /遺伝的背景で維持することができる。ドナー特異的細胞表面マーカーが使用できない場合があり、これらの例では、ドナー細胞の生着とHSC機能を決定することは難しいかもしれません。 性別不適合骨髄移植におけるサザンブロットによってドナー雄性細胞を検出するために、Y染色体特異的DNAプローブを用いて、前記第三輪博士のグループ6によって開発されました。その後、性決定領域YのためのリアルタイムPCRはmaを定量するため、正確かつ特異性の高い方法であることが判明した母体血システム7のLe胎児細胞。この概念は、ドナー細胞の生着8を決定するために、マウス骨髄移植モデルにおけるリアルタイムPCR法の開発のための博士シュワルツェンバーガーのグループが適応されました。我々はさらにFVB / NJマウス骨髄移植モデルのドナー細胞の生着を​​測定するためのこの方法を変更しました。このメソッドは、現在広くHSCの生物学におけるPIM1キナーゼの役割を研究するために我々のグループで利用されている。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone社</td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16140-017 </td><td>不活性化された熱</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素カリウム</td><td>フィッシャー</td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp調製DNAは血液minikit </td><td>キアゲン</td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>バイオサイエンスのBD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IQ SYBR Green Supermixを</td><td>バイオラッド</td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5リアルタイムPCR装置</td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スペクトル光度計</td><td>ナノドロップND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

マウス骨髄移植モデルは、造血幹細胞（HSC）の機能および決定遺伝子/ HSCを調節する分子を測定する際の重要なツールを提供します。これらの移植モデルシステムでは、造血幹細胞の機能が生着し、再構成する致死量の放射線を照射したレシピエントマウスにこれらの細胞の能力によって決定されます。一般的には、ドナー細胞の寄与/生着は、フローサイトメトリーを用いたドナー特異的な細胞表面タンパク質に対する抗体によって測定されます。しかし、この方法は、大きく特異性とすべてのマウス系統では使用できない場合があり、受信者から発信された細胞からドナー由来細胞を区別するために、細胞表面マーカーの能力に依存します。市場では遺伝的に改変されたマウス系統の様々な背景を考えると、この細胞表面/フローサイトメトリーベースの方法は、特にジェニック受け手CEから独立したドナー細胞に明確に定義された表面マーカーを欠いているマウス系統に重大な制限がありますLLS。ここでは、移植レシピエントマウスにおけるドナー細胞の生着/寄与を決定するために、PCRベースの手法を報告した。私たちは、致死量の放射線を照射ジェニック雌マウスに男性ドナー骨髄の造血幹細胞を移植した。末梢血試料を異なる時点の移植後に採取した。骨髄サンプルは、実験の終了時に得られた。ゲノムDNAを単離し、Y染色体特異的遺伝子、Zfy1は、定量的リアルタイムPCRを用いて増幅した。女性レシピエントマウスにおける男性ドナー由来細胞の生着は、男性対女性のDNAの既知の割合で標準曲線に対して算出した。 BCL2は、総DNA量を正規化するために参照遺伝子として用いた。我々のデータは、このアプローチは確実にドナー細胞の生着を​​決定し、マウス骨髄移植モデルにおける造血細胞再構成を測定するのに有用な、まだ簡単な方法を提供することが示唆された。本手法は、日常的にほとんどの研究室で行うことができるため、ノーこのようなフローサイトメトリーなどの高価な機器が必要です。

図1及び図2は、標準曲線の例は男性DNAの割合に対して2-ΔCTの平均値でプロットを示した。 図1Aは 、それぞれ78.5℃、88.5℃でローカライズBCL2とZfy1リコンのための特異的な融解温度を示した。 BCL2は、各PCR反応にロードされたDNAの総量を正規化するために参照遺伝子として使用されます。各標準サンプルのためBCL2増幅曲線は、（ログビュー）ロードされたDNA（ <...

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Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

ドナー細胞の生着を​​決定することは、明確に定義された表現型マーカーを欠くマウス骨髄移植モデルにおける課題を提示する。私たちは、女性の移植レシピエントマウスに男性ドナー細胞の生着を​​定量化するための方法論を説明した。このメソッドは、HSCの機能の研究のためにすべてのマウス系統で使用することができます。

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

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