Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
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우리는 그의 실시간 PCR 기계의 사용 찰스 박사 그린버그 감사드립니다. 이 작품은 MUSC 홀 링스 암 센터 시작 기금, 홀 링스 암 센터 ACS IRG, ASCO 암 재단 경력 개발 상을 정복, NIH 1K08HL 103780-01A1, 그리고 NIH 3P30CA138313-01S3에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 건강 또는 다른 기금 대리인의 국립 연구소의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. 골수 세포 절연 <ol><li> 남성 기증자 FVB / NJ 마우스와 경부 전위 다음 CO 2 방법을 사용하여 여성 FVB / NJ 쥐를 안락사시켜야. 여성 FVB / NJ 골수 세포 경쟁 세포로 사용됩니다. </li><li> 마우스의 대퇴골과 tibiaes을 해부 5 % 열 inactivated FBS 6 ML 얼음처럼 차가운 RPMI1640을 포함하는 60mm 조직 배양 접시에 넣고, 작은 가위와 집게를 사용하십시오. 근육과 다른 조직을 제거 kimwipe 조직을 사용합니다. ...

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	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. 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현재 연구의 목적은 고객에게 경쟁력있는 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 engraftment을 수량화 할 수있는 PCR 기반 기술을 제공하는 것입니다. 여러 연구 이식 모델 9-10에 공여 세포를 감지 할 수 RT-PCR을 사용하여보고되었습니다. 박사 Schwarzenberger의 그룹은 먼저 Y-염색체 별 8 증폭하기 위해 실시간 PCR을 사용하여 손쥐 골수 이식 모델을 개발했습니다. 이 방법은 HSC 활동 11</...

손쥐 골수 (BM) 이식 모델이 처음 1960 년대 1 개발되었습니다. 이 모델은 광범위하게 기증 조혈 줄기 세포 (HSC) 호스트받는 마우스 생물학 연구에 사용되었습니다. 손쥐 골수 이식 모델은 HSC 기능과 규제에 대한 귀중한 지식으로 우리를 제공하고 HSC 연구에 필수 불가결합니다. C56Bl/6J CD45.2 - B6.SJL CD45.1 같은 C57Bl/6J H2b-Balb / C H2d 또는 congenic 이식 모델 같은 Allogeneic 골수 이식 모델은 효과, HSC 활동 2 유전자 기능을 연구하기 위해 여러 실험실에서 사용되는 이러한 이식 - 대 - 호스트 질병 (GvHD) 4 등 HSC 기능 3 이식 관련 질환에 대한 약물 치료. 이러한 MHC haplotype 또는 CD45.1 등의 세포 표면 마커는 일반적으로받는 사람 - 유래 세포에서 구별 기증자 파생 셀에 사용됩니다. C57Bl/6J H2b, CD45.2 </su기증자 세포 기여 쉽게 CD45.1 대 CD45.2 또는 H2b 대를 측정 유동 세포 계측법에 의해 평가 될 수 있기 때문에 P는&gt;, Balb / C H2d 및 B6.SJL CD45.1는 골수 이식에서 가장 일반적으로 사용되는 마우스 변종 아르 H2d. 그러나, 이러한 FVB / NJ 5 C3H 등 여러 다른 변종은 종종 유전 공학 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스를 생성하는 데 사용됩니다. 이 마우스는 타고난 줄에 backcrossed와 혼합 MHC / 유전 배경에서 유지 될 수 있습니다. 기증자 특정 세포 표면 마커를 사용할 수 없습니다 이러한 경우에는 기증자 세포 engraftment 및 HSC 기능을 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 섹스 일치하지 않는 골수 이식의 남부 얼룩으로 기증자 남성 세포를 감지하는 Y-염색체 특정 DNA 프로브를 사용하면 첫째 박사 미와의 그룹 6 개발되었습니다. 그런 다음 섹스를 결정 지역 Y에 대한 실시간 PCR은 교장 quantitate 할 수있는 정확하고 구체적인 방법으로 발견되었다산모 혈액 시스템 7 르 태아 세포. 이 개념은 공여 세포 engraftment 8 결정하는 손쥐 골수 이식 모델에서 실시간 PCR 기술의 개발을위한 박사 Schwarzenberger의 그룹에 의해 조정되었다. 우리는 더 FVB / NJ 마우스 골수 이식 모델에서 기증자 세포 engraftment의 측정을 위해이 방법을 수정했습니다. 이 방법은 현재 광범위하게 HSC 생물학 Pim1 키나제의 역할을 공부에 대한 우리의 그룹에 사용된다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> inactivated 열 </td></tr><tr><td> 염화 암모늄 </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> 칼륨 중탄산염 </td><td> 어부 </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA 혈액 minikit </td><td> Qiagen </td><td> 51,106 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ의 SYBR 그린 supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 실시간 PCR 기계 </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 측광 </td><td> ND-1000 Nanodrop </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

손쥐 골수 이식 모델은 조혈 줄기 세포 (HSC) 기능과 결정 유전자 / HSCs를 조절 분자를 측정에 중요한 도구를 제공합니다. 이러한 이식 모델 시스템에서 HSCs의 기능이 합치다 및 reconstitute lethally 방사능받는 마우스에 이러한 세포의 능력에 의해 결정됩니다. 일반적으로, 기증자 세포 기여 / engraftment는 유동 세포 계측법을 사용하여 기증자 특정 세포 표면 단백질에 대한 항체에 의해 측정됩니다. 그러나,이 방법은 크게 특이성 및 모든 마우스 변종을 사용할 수 없습니다 수신자 - 유래 세포에서 기증자 파생 세포를 차별화 할 수있는 세포 표면 마커의 능력에 따라 달라집니다. 시장에서 유전자 변형 마우스 변종의 다양한 배경을 고려,이 세포 표면 / 흐름 세포 계측법 기반의 방법은 특히 congenic받는 CE에서 별도의 기증자 세포에 잘 정의 된 표면 마커를 결여 마우스 변종에 상당한 한계를 가지고있다재편. 여기, 우리는 이식받는 마우스에 기증자 세포 engraftment / 공헌을 결정하는 PCR 기반 기술을 발표했다. 우리는 lethally 방사능 congenic 여성 마우스로 남성 기증 골수 HSCs를 이식. 주변 혈액 샘플은 다른 시간 지점 게시물 이식에서 수집되었다. 골수 샘플은 실험의 끝에 획득했다. 게놈 DNA의 고립 된와 Y 염색체 특정 유전자 Zfy1은 정량 실시간 PCR을 사용하여 증폭되었다. 여성받는 쥐 남성 기증자 파생 세포의 engraftment는 남성 대 여성 DNAs의 알려진 비율과 표준 곡선으로부터 계산되었다. Bcl2은 전체 DNA 금액을 정상화 할 수있는 참조 유전자로 사용되었다. 우리의 데이터는 접근이 안정적으로 공여 세포 engraftment을 결정하고 손쥐 골수 이식 모델에서 조혈 세포 reconstitution을 측정에 유용하면서도 간단한 방법을 제공합니다 것을 제안했습니다. 우리의 방법은 정기적으로 대부분의 실험실에서 수행 할 수 있기 때문에 더이러한 유동 세포 계측법과 같은 비용이 많이 드는 장비가 필요합니다.

그림 1과 2는 표준 곡선의 예는 남성 DNA의 비율에 대한 2 δCt의 평균 값으로 꾸몄다 보여 주었다. 그림 1A는 각각, 78.5 ° C와 88.5 ° C에서 지역화 Bcl2 및 Zfy1 amplicons에 특정 녹는 온도를 보여 주었다. Bcl2는 각 PCR 반응에로드 DNA의 총 양을 정상화 할 수있는 참조 유전자로 사용됩니다. 각 표준 시료에 대한 Bcl2 증폭 곡선 (로그보기)로드의 DNA (그림 1B)의 동등...

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Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

기증자 세포 engraftment을 결정하는 것은 잘 정의 phenotypical 마커를 부족 마우스 골수 이식 모델에서 도전을 선물한다. 우리는 여성 이식받는 마우스의 남성 기증자 세포 engraftment을 수량화하는 방법을 설명했다. 이 방법은 HSC 기능의 연구에 대한 모든 마우스 변종에 사용할 수 있습니다.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

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