Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Vi takker Dr. Charles Greenberg for bruk av hans Real time PCR maskin. Dette arbeidet støttes av MUSC Hollings Cancer Center Oppstart Fund,, ASCO Hollings Cancer Center ACS IRG Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103780-01A1, og NIH 3P30CA138313-01S3. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over National Institutes of Health eller andre finansieringskilder agenter.

1. Bone Marrow celleisolasjon <ol><li> Avlive mannlige donor FVB / NJ mus og kvinnelige FVB / NJ mus med CO 2-metoden etterfulgt av cervical forvridning. Den kvinnelige FVB / NJ benmargceller vil bli brukt som konkurransedyktige celler. </li><li> Bruk små saks og tang, dissekere ut lårben og tibiaes fra mus og plassere dem i en 60 mm vev kultur tallerken med 6 ml iskald RPMI1640 med 5% varmeinaktivert FBS. Bruk kimwipe vev for å fjerne muskler og annet vev. Skjær av begge endene av hver bein aksel i par...

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

Målet med vår nåværende studien er å gi publikum en PCR-basert teknikk for å kvantifisere donorcellen engraftment i et konkurranseutsatt murine benmargstransplantasjon modell. Flere studier har rapportert hjelp RT-PCR for å påvise donor celler i transplantasjon modeller 9-10. Dr. Schwarzenberger gruppe først utviklet en murine benmargstransplantasjon modellen bruker real-time PCR for å forsterke y-kromosom-spesifikke 8. Denne metoden ble brukt for å studere Gli-1 funksjon i HSC aktivitet...

Murine benmarg (BM) transplantasjon modellen ble først utviklet i 1960 en. Denne modellen har vært mye brukt for å studere donor stamcelletransplantasjon (HSC) biologi i en rekke mottaker mus. Murine benmargstransplantasjon modellen har gitt oss verdifull kunnskap om HSC funksjoner og deres regulering og er uunnværlig i HSC forskning. Allogen benmargstransplantasjon modell som C57Bl/6J H2B-Balb / C H2d eller congenic transplantasjon modell som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 brukes i mange laboratorier for å studere gen-funksjon på HSC aktivitet 2, effekt av medikamentell behandling på HSC funksjon 3 eller transplantasjon relaterte sykdommer som graft-versus-host sykdom (GVHD) 4. Celleoverflaten markører som MHC haplotype eller CD45.1 blir ofte brukt for å skille donor-avledet celler fra mottaker-stammer celler. C57Bl/6J H2B, CD45.2 </sup&gt;, Balb / C H2d og B6.SJL CD45.1 er de mest brukte muselinjer i benmargstransplantasjon fordi donorcellen innsats kan lett vurderes av flowcytometri måle CD45.1 vs CD45.2 eller H2B vs H2d. Men mange andre stammer som FVB / NJ 5 og C3H også ofte brukt til å generere genmodifisert transgene eller knockout mus. Disse musene kan backcrossed til en innavlet linje og vedlikeholdes på en blandet genetisk / MHC bakgrunn. I disse tilfellene kan bestemme donorcellen engraftment og HSC funksjon være vanskelig som donor spesifikke-celle overflate markører ikke kan være tilgjengelige. Bruke Y-kromosom-spesifikke DNA-probe for å oppdage donor mannlige celler ved Southern blot i sex-feilaktige benmargstransplantasjon ble først utviklet av Dr. Miwa gruppe 6. Deretter ble en real-time PCR for sex-fastsettelse region Y funnet å være en nøyaktig og svært spesifikk metode for å kvantifisere male fosterets celler i mors blod systemet 7. Dette konseptet ble tilpasset av Dr. Schwarzenberger gruppe for utvikling av en real-time PCR teknikk i en murine benmargstransplantasjon modellen til å bestemme donorcellen engraftment 8. Vi ytterligere modifisert denne metoden for måling av donor celle engraftment i FVB / NJ mus benmargstransplantasjon modell. Denne metoden er for tiden mye brukt i vår gruppe for å studere rollen til Pim1 kinase i HSC biologi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Varmeinaktivert </td></tr><tr><td> Ammoniumklorid </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumbikarbonat </td><td> Fisher </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA Blood MINIKIT </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> BD biovitenskap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Grønn SuperMix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 real time PCR maskin </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotometer </td><td> NanoDrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

Murine benmargstransplantasjon modellene gir et viktig verktøy for å kunne måle stamcelletransplantasjon (HSC) funksjoner og bestemme gener / molekyler som regulerer HSCs. I disse transplantasjon modellsystemer, funksjonen av HSCs bestemmes av evnen til disse cellene til engraft og rekonstituere lethally bestrålte mottaker mus. Vanlig er donorcellen bidrag / engraftment målt av antistoffer mot donor-spesifikke celleoverflatereseptorer proteiner ved hjelp av flow cytometri. Imidlertid avhenger denne metoden tungt på spesifisitet og evne til celleoverflaten markør å differensiere donor-avledede celler fra mottaker-oppsto celler, som ikke er tilgjengelige for alle muselinjer. Vurderer de ulike bakgrunner av genmodifiserte mus stammer i markedet, har denne celleoverflaten / flowcytometri-basert metode betydelige begrensninger spesielt i muselinjer som mangler veldefinerte overflate markører for å skille donor celler fra congenic mottaker ceLLS. Rapporterte vi en PCR-basert teknikk for å bestemme donorcellen engraftment / bidrag i transplantasjoner mottaker mus. Vi transplantert mannlige donor benmarg HSCs til livsfarlige bestrålte congenic hunnmus. Perifert blod prøver ble samlet ved ulike tidspunkt etter transplantasjonen. Beinmargsprøver ble oppnådd på slutten av forsøkene. Genomisk DNA ble isolert og Y kromosomet spesifikt gen, Zfy1, ble amplifisert ved hjelp av kvantitativ Sanntids PCR. Engraftment av mannlige donor-avledet celler i de kvinnelige mottaker mus ble beregnet mot standardkurve med kjent andelen mannlige vs kvinnelige DNA. BCL2 ble brukt som en referanse genet å normalisere det totale DNA beløpet. Våre data antydet at denne tilnærmingen pålitelig bestemmer donorcellen engraftment og gir et nyttig, men likevel enkel metode å måle blodkreft celle rekonstituering i murine benmargstransplantasjon modeller. Vår fremgangsmåte kan rutinemessig utført i de fleste laboratorier fordi ingenkostbart utstyr slik som strømningscytometri er nødvendig.

Figur 1 og 2 viste eksempler på standardkurver plottet med gjennomsnittsverdier for to-δCt mot prosenter av mannlig DNA. Figur 1A viste spesifikk smeltetemperatur for BCL2 og Zfy1 amplikonene lokalisert ved 78,5 ° C og 88,5 ° C, henholdsvis. BCL2 brukes som referanse genet å normalisere den totale mengden loaded DNA i hver PCR-reaksjon. BCL2 forsterkning kurver (Log visning) for hver standard prøve fusjonere med hverandre uavhengig av mannlige DNA konsentrasjon, noe som...

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bestemme donorcellen engraftment en utfordring i mus benmargstransplantasjon modeller som mangler veldefinerte fenotypisk markører. Vi beskrev en metode for å kvantifisere mannlig donor celle engraftment i kvinnelige transplantasjon mottaker mus. Denne metoden kan bli brukt i alle muselinjer for studiet av HSC funksjoner.

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Pre-kliniske Evaluering av tyrosinkinasehemmere for behandling av akutt leukemi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murint Cervical hjertetransplantasjon Model Ved hjelp av en modifisert Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensjonal Tissue Culture modell for å studere Primær Menneskelig Bone Marrow og dets Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhinnen Transplantasjon: En modell for å studere den vanligste formen for organtransplantasjon

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluering av Lung metastaser i Mouse Brysttumormodeller av kvantitativ real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Generering av lukkede femur brudd i mus: en modell for å studere bein Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...