Name: using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Biz onun Real Time PCR makine kullanımı için Dr Charles Greenberg ederim. Bu çalışma MUSC Hollings Kanser Merkezi Başlangıç ​​Fonu, Hollings Kanser Merkezi ACS IRG, ASCO Kanseri Vakfı Kariyer Geliştirme Ödülü Conquer, NIH 1K08HL 103780-01A1 ve NIH 3P30CA138313-01S3 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Sağlık veya diğer finansman ajanlar Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Kemik İliği Hücre İzolasyonu <ol><li> Erkek donör FVB / NJ fareler ve servikal dislokasyon ile takip CO2 yöntemi kullanılarak dişi FVB / NJ fareler Euthanize. Dişi FVB / NJ kemik iliği hücreleri rekabetçi hücreler olarak kullanılır. </li><li> Farelerin femur ve tibiaes üzerinden incelemek ve% 5 ısı inaktive FBS ile 6 ml buz-soğuk RPMI1640 içeren 60 mm doku kültür kaplarına koyun, küçük bir makas ve forseps kullanın. Kas ve diğer dokuları kaldırmak için Kimwipe doku kullanı...

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

Mevcut çalışmanın amacı, izleyicilere rekabetçi bir kemirgen kemik iliği nakli modelinde donör hücre uyumunu ölçmek için PCR temelli bir yöntem sağlamaktır. Çeşitli çalışmalarda, transplantasyonu modelleri 9-10 donör hücrelerini saptamak için RT-PCR kullanılarak bildirilmiştir. Dr Schwarzenberger grubunun ilk y kromozomu özgü 8 yükseltmek için real-time PCR kullanarak bir kemirgen kemik iliği nakli modeli geliştirilmiştir. Bu yöntem, HSC etkinlik 11 Gli-1...

Mürin kemik iliği (Kİ) nakli model ilk 1960 1 geliştirilmiştir. Bu model yaygın donör hematopoetik kök hücre (HSC) bir ana alıcı fare biyoloji çalışma için kullanılır olmuştur. Mürin kemik iliği nakli modeli HSC fonksiyonları ve düzenlenmesi ile ilgili değerli bilgi ile bize sağladı ve HSC araştırma vazgeçilmezdir. C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 gibi C57BL/6J H2b-Balb / C H2d veya congenic nakli modeli gibi Allojenik kemik iliği nakli modelinin etkisi, HSC aktivitesi 2 geninin işlevini incelemek için birçok laboratuarlarda kullanılmaktadır graft-versus-host hastalığı (GVHH) 4 olarak HSC fonksiyonu 3 veya transplantasyon ilişkili hastalıklar üzerinde ilaç tedavisi. Bu tür MHC haplotip veya CD45.1 gibi hücre yüzey belirteçleri yaygın olarak alıcı kökenli hücrelerden ayırt verici türetilmiş hücreler için kullanılmaktadır. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sudonör hücre katkısı kolayca CD45.1 vs CD45.2 veya H2b vs ölçüm akım sitometri ile tespit edilebilir, çünkü p&gt;, Balb / C H2d ve B6.SJL CD45.1 kemik iliği nakli en yaygın olarak kullanılan fare suşları vardır H2d. Bununla birlikte, bu tür FVB / NJ 5 ve C3H gibi birçok diğer bakteriler aynı zamanda sık sık genetik mühendisliği transjenik fareler veya nakavt üretmek için kullanılır. Bu fareler, doğuştan bir hat için backcrossed ve bir karışık MHC / genetik arka plan içinde muhafaza edilebilir. Donör spesifik hücre yüzey belirteçleri mevcut olmayabilir bu durumda, donör hücre uyumunu ve HSC fonksiyonu belirlenmesi zor olabilir. Sex-uyumsuz kemik iliği nakli güney blot donör erkek hücrelerini saptamak için Y-kromozomu-spesifik DNA prob kullanarak ilk Dr Miwa grubu 6 tarafından geliştirilmiştir. Daha sonra, cinsiyet belirleyici bölge Y için bir gerçek-zamanlı PCR ma miktarının belirlenmesi için bir doğru ve büyük ölçüde belirli bir yöntem olduğu bulundumaternal kan sistemi 7 le fetal hücreler. Bu kavram, donör hücre uyumunu 8 belirlemek için bir kemirgen kemik iliği nakli modelinde, bir gerçek-zamanlı PCR tekniğinin geliştirilmesi için Dr Schwarzenberger grubu tarafından adapte edilmiştir. Biz daha FVB / NJ fare kemik iliği nakli modelinde donör hücre engraftman ölçümü için bu yöntemi değiştirilmiş. Bu yöntem, şu anda geniş olarak HSC biyoloji Pim1 kinaz rolünü incelemek için, grup halinde kullanılmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Inaktive Isı </td></tr><tr><td> Amonyum klorid </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Bikarbonat </td><td> Balıkçı </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA Kan MINIKIT </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre süzgeç </td><td> Biyobilim BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 gerçek zamanlı PCR makinesi </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotometre </td><td> ND-1000 Nanodrop </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

Mürin kemik iliği nakli modelleri hematopoetik kök hücre (HSC) fonksiyonları ve belirleyici gen / HKH&#39;lerin düzenleyen molekülleri ölçen önemli bir araç sağlar. Bu transplant modeli sistemlerinde HKH&#39;lerin fonksiyonu sokmak ve sulandırmak öldürücü ışınlanmış alıcı fareler için bu hücrelerinin yeteneği belirlenir. Genellikle, verici katkı hücre / melezleşmesi akış sitometrisi kullanılarak özel bir verici-hücre yüzey proteinleri, antikorlar tarafından ölçülür. Ancak, bu yöntem ağır özgüllük ve tüm fare suşları için geçerli olmayabilir alıcının kaynaklı hücreler, gelen donör kaynaklı hücreler ayırt etmek için hücre yüzey belirteci yeteneğine bağlıdır. Piyasada genetiği değiştirilmiş fare suşlarının çeşitli geçmişlere dikkate alındığında, bu hücre yüzey / akım sitometri tabanlı yöntem özellikle congenic alıcı ce ayrı donör hücreleri iyi tanımlanmış yüzey belirteçleri yoksun fare suşları önemli sınırlamaları vardırlls. Burada, transplant alıcıları farelerde donör hücre engraftman / katkısını belirlemek için PCR-temelli teknik bildirdi. Biz lethally ışınlanmış congenic dişi farelere erkek donörün kemik iliği HKH&#39;lerin nakledilen. Periferal kan numuneleri farklı zaman noktalarında, nakil sonrası toplandı. Kemik iliği örnekleri deneyler sonunda elde edildi. Genomik DNA izole edildi ve Y kromozom özgü gen, Zfy1, kantitatif Gerçek zamanlı PCR ile amplifiye edildi. Dişi alıcı farelerde erkek donör kaynaklı hücrelerinin aşılanması erkek vs kadın DNA&#39;ların bilinen yüzdesi, standart bir eğriye karşı hesaplanır edildi. Bcl2 toplam DNA miktarının normale döndürmek için bir gen referans olarak kullanılmıştır. Bizim verilerimiz bu yaklaşım güvenilir donör hücre uyumunu belirler ve fare kemik iliği nakli modelleri hematopoetik hücre sulandırma ölçmede yararlı, henüz basit bir yöntem sağlar önerdi. Bizim yöntemi rutin en laboratuarlarda yapılabilir çünkü hiçbirgibi flow sitometri gibi pahalı ekipman gereklidir.

Şekil 1 ve 2 standart eğri örnekleri erkek DNA yüzdeleri karşı 2-δCt ortalama değerleri ile çizilen gösterdi. Şekil 1A, sırasıyla 78.5 ° C&#39;de ve 88.5 ° C&#39;de lokalize Bcl2 ve Zfy1 amplikonlar için spesifik erime sıcaklığı göstermiştir. Bcl2 her bir PCR reaksiyonu içinde yüklenmiş DNA&#39;nın toplam miktarı normalleştirmek için bir referans gen olarak kullanılır. Her standart numune için Bcl2 amplifikasyon eğrileri (Log görünümü) yü...

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Donör hücre engraftman belirleme iyi tanımlanmış fenotipik belirteçlerin yoksun fare kemik iliği nakli modelleri bir meydan okuma sunuyor. Biz kadın transplant alıcı fareler erkek donör hücre uyumunu ölçmek için bir metodoloji tanımlamıştır. Bu yöntem, HSC fonksiyonların çalışması için tüm fare suşu olarak da kullanılabilir.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Modifiye Manşet Tekniği Sıçangiller Servikal Kalp Nakli Modeli

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Sıçangiller Kornea Nakli: Katı Organ Nakli En Yaygın Formu Eğitim için Bir Model

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Donör karaciğerleri Ex Situ Normotermik Makinesi Perfüzyonu

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Farelerde kapalı femur kırığı nesil: kemik şifa çalışması için bir Model

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...