Name: metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture at JoVE.com

Wir möchten Amie Regan für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde von NGFN Plus-Grant # 01GS0801, MRC Stipendium Zuschuss G1002523 und NHSBT Zuschuss WP11-05 LD und DFG FR2938/1-1 zu CCF unterstützt

1. Metabolische Markierung mit 4-Thiouridin Machen Sie einen detaillierten Plan des Versuchsaufbaus / schedule, z. B. wenn die 4SU auf Zellkultur hinzufügen und wenn die Proben zu ernten. Plan für mindestens 5 min zwischen jeder Bedingung. Nur behandeln Zellen einer Bedingung zu einer Zeit. Griff max. 3 - 5 Gerichte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Griff Zellen möglichst schnell auf Veränderungen der Temperatur und CO 2-Gehalt zu minimieren. Vermeiden, dass die Zellen dem...

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Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19, 942-945 (1995).</li><li>Friedel, C. C., D&#246;lken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).</li><li>Friedel, C. C., Kaufmann, S., D&#246;lken, L., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HALO+-+A+Java+framework+for+precise+transcript+half-life+determination.">HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination.</a> Bioinformatics. , (2010).</li></ol>

Metabolische Markierung von neu transkribierten RNA wesentlich verbessert die Leistung von High-Throughput-Technologien wie Microarrays und RNA-seq durch die Bereitstellung geeigneter Vorlagen, um die biologische Frage von Interesse anzusprechen. Das vorliegende Protokoll umfangreich Optimierung. Es erlaubt&gt; 1000-fache Anreicherung von neu transkribierten RNA und bietet hoch reproduzierbare Ergebnisse. Der experimentelle Aufbau eines 4SU-Tagging Experiment ist von entscheidender Bedeutung...

Gene Expression Profiling ist ein wichtiges Instrument verwendet, um zelluläre Prozesse und die damit verbundenen komplexen Interaktion Netzwerk studieren. Studien zur mRNA waren typischerweise die Methode der Wahl, um grundlegende Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erhalten. Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays 1 und, in jüngerer Zeit, der nächsten Generation Sequenzierung von RNA (RNA-seq) 2-4 angeheizt diesen Ansatz. Während diese Technologien revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression, stehen sie wesentliche Einschränkungen aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Probe, dh gesamten zellulären RNA. Erstens, kurzfristige Veränderungen in Gesamt-RNA Ebenen nicht übereinstimmen Änderungen in Transkriptionsraten, sind aber von Natur aus abhängig von der RNA-Halbwertszeit der jeweiligen Transkripte. Während eine fünffache Induktion eines kurzlebigen Transkript, zB Codierung für einen Transkriptionsfaktor, wird leicht nachweisbar sein in Gesamt-RNAinnerhalb einer Stunde die gleiche Induktion einer langlebigen Transkript, z. B. Codierung für ein metabolisches Enzym, bleiben nahezu unsichtbar. Darüber hinaus, auch eine komplette Abschaltung (&gt; 1.000-fach Down-Regulation) in der Transkription von durchschnittlich Gen mit einer RNA-Halbwertszeit von fünf Stunden nehmen Sie einfach fünf Stunden seines gesamten RNA-Spiegel von nur zweifache verringern . Daher begünstigt Analyse von Gesamt-RNA die Erkennung von Up-Regulation von kurzlebigen Transkripte, von denen viele für Transkriptionsfaktoren und Gene mit regulatorischen Funktionen 5 codieren. Darüber hinaus wird die tatsächliche kinetische Kaskade Regelung verdunkelt und primären Signalwege nicht von sekundären unterschieden werden. Beide wiederum zu erheblichen Verzerrungen in stromabwärts bioinformaticsanalysen führen. Zweitens können Veränderungen in Gesamt-RNA Levels nicht auf Änderungen in der RNA-Synthese oder Zerfall zugeschrieben werden. Messungen der Letztere erfordern Zelle invasive Ansätze, z. B. Blockierung transcriptizur Verwendung von Actinomycin D 6, und erweiterte Überwachung der laufenden RNA Verfall im Laufe der Zeit. Bei einer mittleren mRNA Halbwertszeit in Säugerzellen von 5 - 10 h 5,7, wird mRNA-Spiegel der meisten Gene nur um weniger als das Doppelte nach mehreren Stunden der transkriptionellen Verhaftung verringert. Diese eher kleine Unterschiede führen in grob ungenaue Messungen von mRNA Halbwertszeiten für die meisten zellulären Genen aufgrund der exponentiellen Natur der zugrunde liegenden mathematischen Gleichungen. Schließlich, während RNA-seq der gesamten zellulären RNA ergab, dass etwa die Hälfte unserer Gene unterliegen alternatives Spleißen Veranstaltungen 8, den zugrunde liegenden Kinetik sowie die dynamischen Mechanismen Führung Gewebe-und Kontext-spezifische Regulation der RNA-Prozessierung noch schwer abzuschätzen sind. Darüber hinaus verarbeitet der Beitrag der RNA zu differentiellen Genexpression, insbesondere für nicht-kodierenden RNAs, bleibt zu bestimmen. Insgesamt stellen diese Einschränkungen Haupthindernisse fürbioinformatische kinetische Modellierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Vor kurzem haben wir eine Methode entwickelt, genannt hochauflösende Genexpressionsanalysen, um diese Probleme zu überwinden 5,7,9. Es basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA unter Verwendung von 4-Thiouridin (4SU-Tagging), ein natürlich vorkommendes Uridinderivat basiert und bietet direkten Zugang zu neu transkribierten Transkripte mit minimaler Störung des Zellwachstums und der Genexpression (siehe Abbildung 1) 5, 10-12. Exposure von eukaryotischen Zellen zu 4SU Ergebnisse in seine schnelle Aufnahme, Phosphorylierung 4SU-Triphosphat und Einbau in neu transkribierten RNA. Nach Isolierung der gesamten zellulären RNA ist die 4SU-markierten RNA-Fraktion Thiol-spezifisch biotinylierte Erzeugen einer Disulfidbrücke zwischen Biotin und den neu transkribierten RNA. &#39;Total zellulären RNA&#39; kann dann quantitativ in markierte (&#39;neu transkribiert&#39;) und unmarkierten (&#39;pre-existin getrennt werdeng &#39;) RNA mit hoher Reinheit unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Schließlich wird markierten RNA aus den Perlen durch Hinzufügen eines Reduktionsmittels (z. B. Dithiothreitol) Spalten der Disulfidbrücke und Lösen der neu transkribierten RNA aus den Perlen zurückgewonnen. Neu transkribiert RNA zeigt die transkriptionelle Aktivität von jedem Gen während des Zeitrahmens 4SU Exposition. 4SU-Tagging in der Zeitskala von Minuten stellt somit eine Momentaufnahme der eukaryotischen Genexpression und eine ideale Vorlage für down-stream bioinformatischen Analysen (z. B. Promotor-Analyse). In Fällen, in denen stationären Bedingungen angenommen werden kann, die Verhältnisse neu transkribiert / total neu transkribiert / unmarkiertem und unmarkierten / Gesamt-RNA liefern nicht-invasiven Zugang zu präzisen RNA Halbwertszeiten 7,13. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die neu transkribierten RNA nach nur 5 min von 4SU-Tagging (5 min 4SU-RNA) gereinigt beachten ist jünger als 15 und 60 min 4SU-RNA.Bei der Durchführung sowohl ultra-kurz und zunehmend länger 4SU-Tagging in einem experimentellen Setting mit RNA-seq kombiniert, werden die Kinetik der RNA-Prozessierung bei Nukleotid Auflösung 9 offenbart. Schließlich erlauben Zeitverlauf Analysen neu transkribiert und Gesamt-RNA mit Computermodellen kombiniert eine integrative Analyse der RNA-Synthese und Zerfall 14. Zusammenfassend kann dieser Ansatz zur direkten Analyse der Dynamik der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zersetzung in eukaryotischen Zellen. Es gilt in allen wichtigen Modellorganismen einschließlich Säugetiere, Insekten (Drosophila), Amphibien (Xenopus) und Hefe 5,15,16. Es ist direkt kompatibel mit Microarray-Analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, und gilt in vivo 12,15. Hier haben wir ausführlich die Methodik zu beschriften, zu isolieren und zu reinigen, neu transkribierten RNA in kultivierten Säugetierzellen. Darüber hinaus Potentiometeral Probleme und Fallstricke werden diskutiert.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
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metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays und Sequenzierung der nächsten Generation revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression. Zusammen mit einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen beteiligt sind genaue Messungen der zugrundeliegenden Kinetik immer wichtiger. Hier stehen diese leistungsstarken Methoden wesentliche Einschränkungen aufgrund intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Proben sie studieren, dh gesamten zellulären RNA. In vielen Fällen Veränderungen in zelluläre Gesamt-RNA entstehen entweder zu langsam oder zu schnell, um die molekularen Mechanismen und deren Kinetik mit ausreichender Auflösung darzustellen. Darüber hinaus werden der Beitrag der Änderungen in der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zerfall nicht ohne weiteres unterschieden. Wir haben vor kurzem entwickelte hochauflösende Genexpressionsanalysen, diese Einschränkungen zu überwinden. Unser Ansatz basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-thiouri Basisdine (daher auch als 4SU-Tagging bezeichnet) durch rigorose Reinigung neu transkribiert RNA mit Thiol-spezifische Biotinylierung und Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt. Es ist für einen breiten Bereich von Organismen einschließlich Vertebraten, Drosophila und Hefe. Wir haben erfolgreich angewendet 4SU-Tagging, um Echtzeit-Kinetik der Transkriptionsfaktor Aktivitäten zu untersuchen, liefern präzise Messungen der RNA Halbwertszeiten und erhalten neue Einblicke in die Kinetik der RNA-Prozessierung. Schließlich können Computermodelle eingesetzt, um eine integrierte, umfassende Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erzeugen.

1. Ausgangsmaterial und erwartete Renditen Nach 1 Std. (hr) von 4SU-Exposition neu transkribierten RNA entspricht etwa 1-4% der gesamten zellulären RNA. Dies wird niedriger sein Wachstum verhaftet Zellen, da sie nicht mehr synthetisieren RNA zur Rechenschaft für das Zellwachstum / Replikation. Als Kennzeichnung für 1 Stunde, empfehlen wir der Testdurchführung mit 60 - 80 ug Gesamt-RNA. Beginnend mit weniger als 30 ug Gesamt-RNA Ergebnisse in kleinen RNA-Pellets, die schwer nach der Biotinyl...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...