Name: metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture at JoVE.com

हम पांडुलिपि के सावधान पढ़ने के लिए Amie रेगन को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम एलडी और CCF को DFG अनुदान FR2938/1-1 को NGFN प्लस अनुदान # 01GS0801, एमआरसी फैलोशिप अनुदान G1002523 और NHSBT अनुदान WP11-05 के द्वारा समर्थित किया गया

1. 4 thiouridine साथ मेटाबोलिक लेबल प्रयोगात्मक सेटअप / निर्धारित समय से एक विस्तृत योजना बनाओ, सेल संस्कृति को 4sU जोड़ने के लिए जब और नमूने फसल के लिए जब उदा. हर हालत के बीच में कम से कम 5 मिनट के लिए यो?...

<ol>
	<li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. 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Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19, 942-945 (1995).</li><li>Friedel, C. C., D&#246;lken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).</li><li>Friedel, C. C., Kaufmann, S., D&#246;lken, L., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HALO+-+A+Java+framework+for+precise+transcript+half-life+determination.">HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination.</a> Bioinformatics. , (2010).</li></ol>

नव लिखित आरएनए की मेटाबोलिक लेबलिंग काफी रुचि के जैविक सवाल का पता करने के लिए अधिक उपयुक्त टेम्पलेट्स प्रदान करके डीएनए और आरएनए seq तरह उच्च throughput प्रौद्योगिकियों की शक्ति को बढ़ाता है. वर्तमान प्रोटो?...

जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा सेलुलर प्रक्रियाओं और जुड़े जटिल बातचीत नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण उपकरण है. MRNA के बहुतायत पर अध्ययन आमतौर पर अंतर्निहित आणविक तंत्र में बुनियादी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए पसंद की विधि से किया गया है. पूरे transcriptome प्रोटीन 1 और, आरएनए (आरएनए सेक) 2-4 से अधिक हाल ही में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के विकास के इस दृष्टिकोण को शह. इन प्रौद्योगिकियों सेलुलर जीन अभिव्यक्ति की जटिलता की हमारी समझ में क्रांति ला दी है, वहीं वे अपने टेम्पलेट नमूना के आंतरिक गुणों, यानी कुल सेलुलर शाही सेना के कारण प्रमुख सीमाओं का सामना. कुल शाही सेना के स्तर में प्रथम, अल्पकालिक परिवर्तन प्रतिलेखन दरों में परिवर्तन से मेल, लेकिन शाही सेना संबंधित टेप के आधे जीवन पर स्वाभाविक निर्भर नहीं कर रहे हैं. एक प्रतिलेखन कारक के लिए एक अल्पकालिक प्रतिलिपि, जैसे एन्कोडिंग की एक पांचगुना प्रेरण, कुल शाही सेना में आसानी से पता लगाने योग्य हो जाएगाएक घंटे के भीतर, एक चयापचय एंजाइम के लिए एक लंबे समय रहते प्रतिलिपि, जैसे एन्कोडिंग का एक ही प्रेरण, लगभग अदृश्य रहेगा. इसके अलावा, यह भी एक बंद नीचे (&gt; 1,000 गुना नीचे विनियमन) एक शाही सेना के पांच घंटे के आधे जीवन के साथ एक औसत जीन प्रतिलेखन दर में पूरी बस केवल दुगना से कम करने के लिए अपने कुल शाही सेना के स्तर के लिए पांच घंटे लगेंगे . इसलिए, कुल शाही सेना के विश्लेषण विनियामक कार्यों 5 के साथ प्रतिलेखन कारक और जीनों के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, जिनमें से कई अल्पकालिक टेप के ऊपर विनियमन का पता लगाने के पक्ष में है. इसके अलावा, विनियमन का सच गतिज झरना छिप जाता है और प्राथमिक संकेत घटनाओं माध्यमिक से भेदभाव नहीं किया जा सकता. दोनों, बारी में, बहाव के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण में पर्याप्त पूर्वाग्रह में हो सकता है. दूसरा, कुल शाही सेना के स्तर में परिवर्तन शाही सेना संश्लेषण या क्षय में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता. बाद के माप transcripti अवरुद्ध सेल आक्रामक दृष्टिकोण, जैसे की आवश्यकताactinomycin डी 6, और समय के साथ चल रही शाही सेना क्षय की विस्तारित निगरानी के प्रयोग पर. 5 के स्तनधारी कोशिकाओं में एक मतलब mRNA के आधे जीवन के साथ - 10 घंटा 5,7, सबसे जीन की mRNA स्तर केवल दुगना ट्रांसक्रिप्शनल गिरफ्तारी के कई घंटे निम्न से कम से कम होगा. ये बल्कि छोटे मतभेदों अंतर्निहित गणितीय समीकरणों के घातीय प्रकृति की वजह से सेलुलर जीनों के बहुमत के लिए mRNA आधा जीवन की निहायत imprecise माप में परिणाम. अंत में, जबकि कुल सेलुलर शाही सेना के आरएनए seq के हमारे जीन में से आधे से लगभग वैकल्पिक splicing घटनाओं 8, अंतर्निहित कैनेटीक्स के साथ ही बुरा समझा रहते आरएनए प्रसंस्करण के ऊतक और संदर्भ विशेष विनियमन मार्गदर्शक गतिशील तंत्र के अधीन हैं कि पता चला. इसके अलावा, शाही सेना का योगदान विशेष रूप से गैर कोडन RNAs के लिए, निर्धारित किया है, अंतर जीन की अभिव्यक्ति के लिए संसाधन. कुल मिलाकर, इन सीमाओं के लिए प्रमुख बाधाओं का प्रतिनिधित्वअंतर्निहित आणविक तंत्र की bioinformatic गतिज मॉडलिंग. हमने हाल ही में इन समस्याओं 5,7,9 काबू पाने के लिए, कहा जाता है उच्च संकल्प जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा, एक दृष्टिकोण विकसित किया है. यह 4 thiouridine (4sU टैगिंग), एक स्वाभाविक रूप से होती uridine व्युत्पन्न का उपयोग नव लिखित आरएनए की चयापचय लेबलिंग के आधार पर, और सेल के विकास और जीन अभिव्यक्ति में कम से कम हस्तक्षेप (चित्रा 1 देखें) 5 के साथ नव लिखित टेप के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है 10-12. इसकी तेजी से तेज, 4sU-ट्रायफ़ोस्फेट को phosphorylation, और नव लिखित शाही सेना में शामिल करने में 4sU परिणाम के लिए कोशिकाओं का एक्सपोजर. कुल सेलुलर शाही सेना के अलगाव के बाद, 4sU लेबल शाही सेना अंश thiol विशेष रूप बायोटिन और नव लिखित शाही सेना के बीच एक डाइसल्फ़ाइड बांड पैदा biotinylated है. &#39;कुल सेलुलर आरएनए&#39; तो मात्रात्मक (&#39;नव लिखित&#39;) और unlabeled (&#39;पूर्व existin लेबल में विभाजित किया जा सकता हैstreptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग उच्च शुद्धता के साथ जी &#39;) आरएनए. अंत में, लेबल शाही सेना बस डाइसल्फ़ाइड बांड cleaving एक कम करने एजेंट (जैसे dithiothreitol) को जोड़ने और मोतियों से नव लिखित आरएनए रिहा द्वारा मोतियों से बरामद किया है. नव लिखित आरएनए 4sU जोखिम की समय सीमा के दौरान हर जीन के transcriptional गतिविधि को दर्शाया गया है. मिनट के timescale में 4sU टैगिंग इस प्रकार यूकेरियोटिक जीन अभिव्यक्ति का एक स्नैपशॉट चित्र और डाउन स्ट्रीम bioinformatic विश्लेषण करती है (उदाहरण के प्रमोटर विश्लेषण) के लिए एक आदर्श टेम्पलेट प्रदान करता है. स्थिर राज्य की स्थिति माना जा सकता है जहां मामलों में, के अनुपात नव लिखित / कुल, नव लिखित / unlabeled और unlabeled / कुल शाही सेना सटीक आरएनए आधा जीवन 7,13 करने के लिए गैर इनवेसिव पहुँच प्रदान करते हैं. इसके अलावा, यह 4sU टैगिंग के रूप में छोटे रूप में 5 मिनट (5 मिनट 4sU-आरएनए) के बाद शुद्ध कि नव लिखित आरएनए नोट करना महत्वपूर्ण है 15 और 60 मिनट 4sU-शाही सेना की तुलना में छोटी है.आरएनए seq के साथ संयुक्त एक भी प्रयोगात्मक सेटिंग में 4sU टैगिंग अति लघु और उत्तरोत्तर अब दोनों प्रदर्शन, आरएनए प्रसंस्करण के कैनेटीक्स न्यूक्लियोटाइड संकल्प 9 में पता चला रहे हैं. अंत में, कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के साथ संयुक्त नव लिखित और कुल शाही सेना के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण शाही सेना संश्लेषण और क्षय 14 के एक एकीकृत विश्लेषण अनुमति देते हैं. अंत में, इस दृष्टिकोण कोशिकाओं में शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण, और गिरावट की गतिशीलता के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. यह स्तनधारी, कीड़े (ड्रोसोफिला), उभयचर (Xenopus), और खमीर 5,15,16 सहित सभी प्रमुख मॉडल जीवों में लागू है. यह माइक्रोएरे विश्लेषण 5,17, आरएनए seq के 9,13,14 साथ सीधे संगत है, और इन विवो 12,15 में लागू है. यहाँ, हम विस्तार पद्धति, लेबल को अलग, और सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में नव लिखित आरएनए को शुद्ध करने के लिए. इसके अलावा, potenti मेंअल समस्याओं और नुकसान पर चर्चा कर रहे हैं.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

पूरे transcriptome प्रोटीन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के विकास सेलुलर जीन अभिव्यक्ति की जटिलता की हमारी समझ में क्रांति ला दी है. इसमें शामिल आणविक तंत्र की एक बेहतर समझ के साथ साथ, अंतर्निहित कैनेटीक्स के सटीक मापन तेजी से महत्वपूर्ण बन गए हैं. इधर, इन शक्तिशाली तरीके टेम्पलेट नमूने वे अध्ययन, यानी कुल सेलुलर शाही सेना के आंतरिक गुणों के कारण प्रमुख सीमाओं का सामना. कई मामलों में कुल सेलुलर शाही सेना में बदलाव के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ अंतर्निहित आणविक घटनाओं और उनके कैनेटीक्स का प्रतिनिधित्व करने के लिए या तो बहुत धीरे धीरे या भी जल्दी होते हैं. इसके अलावा, शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण, और क्षय में परिवर्तन के योगदान को आसानी से भेदभाव नहीं कर रहे हैं. हमने हाल ही में इन सीमाओं को पार करने के लिए उच्च संकल्प जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा विकसित. हमारा दृष्टिकोण 4 thiouri साथ नव लिखित आरएनए की चयापचय लेबलिंग पर आधारित हैभोजन (इस प्रकार भी 4sU टैगिंग के रूप में) thiol विशेष biotinylation और streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग नव लिखित शाही सेना के कठोर शुद्धि द्वारा पीछा किया. यह रीढ़, ड्रोसोफिला, और खमीर सहित जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है. हम सफलतापूर्वक, प्रतिलेखन कारक गतिविधियों की वास्तविक समय कैनेटीक्स अध्ययन आरएनए आधा जीवन की सटीक मापन प्रदान करते हैं, और शाही सेना प्रसंस्करण के कैनेटीक्स में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए 4sU टैगिंग लागू. अंत में, कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग अंतर्निहित आणविक तंत्र का एक एकीकृत, व्यापक विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

1. शुरू सामग्री और अपेक्षित पैदावार 4sU जोखिम के 1 घंटे (एचआर) के बाद नव लिखित आरएनए 1 के बारे में प्रतिनिधित्व करता है - कुल सेलुलर शाही सेना के 4%. वे अब सेल के विकास / प्रतिकृति के लिए खाते में शाही से?...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

कुल सेलुलर शाही सेना अल्पकालिक शाही सेना संश्लेषण और क्षय में परिवर्तन के साथ ही शाही सेना प्रसंस्करण के कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए एक गरीब टेम्पलेट प्रदान करता है. यहाँ, हम 4 thiouridine साथ नव लिखित आरएनए की चयापचय लेबलिंग का वर्णन इन सीमाओं को पार करने की अनुमति नव लिखित आरएनए की thiol विशेष biotinylation और शुद्धि द्वारा पीछा किया.

सेल संस्कृति में शाही सेना संश्लेषण, प्रसंस्करण और क्षय के उच्च संकल्प जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए नव लिखित आरएनए की मेटाबोलिक लेबल

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

प्राथमिक electroporation के लिए murine अस्थि मज्जा से hematopoietic सेल संस्कृतियों की तैयारी

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

भ्रूणीय Zebrafish और सीडीएनए संश्लेषण से जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए शाही सेना अलगाव

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए जीन एक्सप्रेशन अध्ययन सरल: आईएल-4 निर्भर जीन एक्सप्रेशन के Namalwa कक्ष में siRNA नॉकडाउन

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

प्रेरण और सेल संस्कृति में Hypoxia का परीक्षण

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

इन विट्रो प्रतिलेखन और Gaussia luciferase mRNA की कैपिंग HeLa सेल प्रोटोकॉल के द्वारा पीछा किया

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine रिच के चयापचय लेबल रेडियोधर्मी फास्फेट के साथ Kinases 1 और 2 दोहराएँ

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia निम्नलिखित एकल कोशिका के स्तर पर ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण का विश्लेषण

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

मेटाबोलिक दर के मापन में<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Respirometry का उपयोग

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

आरएनए अनुक्रमण परख जीन एक्सप्रेशन और जीनोमिक बदलाव विशेषताएँ करने का लक्ष्य

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

द्वारा शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन का पता लगाने<em&gt; इन विट्रो</emवसाकोशिका संस्कृति में&gt; आरएनए पुल से नीचे

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...