Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Bofan Wu og Christian Raithel til teknisk bistand og Michael Rieger for hans introduktion til live-cell imaging. Understøttet af NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) program gennem National Research Foundation of Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (R31-10.069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Facility Equipment), og NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi og Imaging og Animal Shared Resources).

<html> 1. Samlet Scheme <ol><li> Generere primære kulturer af præneoplastiske mammae epitelceller fra mælkekirtler i gensplejsede og styre vildtypemus. </li><li> Optager direkte-celle billeder hvert 15. minut ved hjælp Volocity billedoptagelse software (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) i op til 5 dage. </li><li> Se time-lapse billeder direkte at vurdere timing og mekanisme af epitelcelle kolonidannelse, forekomst af apoptose, og udfasning af morfologiske ændringer. </li><li> Konverter genereret Volocity. T...

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Kritiske trin Det er vigtigt at sikre, at mælkekirtlerne høstes fra mus på samme alder at kontrollere for aldersrelateret variabilitet i brystkirtler epitelcelle adfærd. Når udpladning af cellerne, burde det samme antal celler udpladet i hver brønd i hvert eksperiment. Celler bør være relativt sparsom ved udpladning således at kulturerne ikke bliver sammenflydende for hurtigt gør det muligt at følge flere individuelle celler gennem serielle billeder. Det er afgørende, at pladen ækv...

Gensplejsede musemodeller er værktøjer til at undersøge og forstå, hvordan forskellige genetiske læsioner bidrager til risikoen for at udvikle brystkræft. For eksempel har genetisk modificerede mus vist, at kombinationen af tre faktorer: tab af fuldlængde brystkræft 1, tidlig begyndelse (BRCA1) gen i mammale epitelceller, tumor protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency, og brystepitelceller celle målrettet opreguleret østrogen receptor alpha (ERA) ekspression resulterer i udviklingen af brystcancer i 100% af BRCA1 floxet (f) 11/f11/Mouse brysttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyclin transaktivator (rtTA mus ved 12 måneders alderen i forhold til de lavere procentsatser rapporteret i BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - mus uden ERA overekspression (~ 50 - 60%) og BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre mus uden TP53 haploinsuftet (&lt;5%). en Dynamisk time-lapse billeder af adfærd præneoplastiske primære brystepitelceller celler afslører forskelle i celle adfærd, der er mindre let værdsat i statiske vævssnit. Ændringer i proliferation og differentiering er observeret i primære mammae celler fra menneskelige BRCA1 mutation luftfartsselskaber. 2 Oprettelse af enkelt-cellesuspensioner af primære brystepitelceller celler fra normal og gensplejsede mus genereres gennem enzymatisk disassociation af resekterede mælkekirtelvævet. 3 Time-lapse billeder er set at vurdere mekanisme og timingen af ​​celle-koloni udseende og forekomsten af ​​morfologiske ændringer i celler, herunder epitel-mesenchymale overgang (EMT) og apoptose. Generering af celle skæbne kort, er kvantificering af længden af ​​tid mellem celledelinger (celle levetid), og bestemmelse af mønstre af celledeling lettes ved anvendelse af encellede tracking. Timm&#39;S Tracking Tool (TTT) er offentligt tilgængelig software, der bruges til at generere encellede skæbne kort. Dens anvendelighed til belysning mekanismer celle skæbne er etableret 4,5 undersøge normale hæmatopoietiske stamceller udvikling 6-9 og dannelse af neuroner. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn reagens </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05.610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B spredning Supplements Mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05.612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinant human epidermal vækstfaktor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02.633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.912 </td><td></td></tr><tr><td> Engangs Scapels </td><td> Feather </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37.150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 pm cell strainer </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27.305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06.100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15.140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Time-lapse billeddannelse kan anvendes til at sammenligne adfærden af ​​dyrkede primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra forskellige genetisk manipulerede musemodeller for brystkræft. For eksempel kan tidsrummet mellem celledelinger (celle levetid), apoptotiske celleantal, udviklingen af ​​morfologiske ændringer, og mekanismerne for kolonidannelse kvantificeres og sammenlignes med celler, der bærer specifikke genetiske læsioner. Primære brystepitelceller cellekulturer genereres fra mælkekirtlerne uden palpable tumor. Kirtler er nøje resekteres med klar adskillelse fra tilstødende muskel, er lymfeknuder fjernet, og enkelt-cellesuspensioner af berigede mammae epitelceller genereres af hakning brystvæv efterfulgt af enzymatisk dissociation og filtrering. Enkelt-cellesuspensioner udplades og anbringes direkte under et mikroskop i en inkubator kammer til live-cell imaging. Seksten 650 um x 700 um felter i en 4x4 konfiguration fra hver well af en 6-brønds plade afbildes hvert 15. minut i 5 dage. Time-lapse billeder undersøges direkte at måle cellulære adfærd, der kan omfatte mekanismen og hyppigheden af ​​celle-kolonidannelse under de første 24 timer af udpladning af cellerne (sammenlægning versus celleproliferation), forekomst af apoptose, og udfasning af morfologiske ændringer. Encellede sporing anvendes til at generere celle skæbne kort til måling af enkelte celle levetid og undersøgelse af celledeling mønstre. Kvantitative data er statistisk analyseret for at vurdere for store forskelle i adfærd korreleret med specifikke genetiske læsioner.

Epithel og fibroblast-celler kan skelnes ved cellemorfologi. Epitelceller har en kubisk form (figur 1A-B) og danner cellekolonier (figur 1A). Fibroblaster, en type stromal celle, har en aflang morfologi (figur 1C). Celler blev afrundet og flydende ved begyndelsen af billeddannelse (fig. 2A-D). Efter binding til pladen blev de flade og demonstrerede et kubisk-typen udseende (figur 2E, H). Med 4 dages dyrkning...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse billeddannelse til at vurdere adfærd primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra genetisk manipulerede musemodeller af risikoen for brystkræft for at bestemme, om der er sammenhænge mellem bestemte adfærdsmæssige parametre og forskellige genetiske læsioner.

Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Eksperimentel Generering af Carcinoma-associerede fibroblaster (cafeer) fra Human brystkirtler fibroblaster

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Levende Imaging af Drug respons i den tumormikromiljøet i musemodeller af Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133<sup&gt; +</sup&gt; Formodede kræftstamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering af østrogen-regulerede MicroRNA i brystkræftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Fremgangsmåde til at opnå primær ovariecancer celler fra Solid Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Ortotopisk Injektion af brystkræft celler i brystfedtpuden af ​​mus til at studere tumorvækst.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Sporing mælke- arkitektoniske træk og Afsløring brystkræft med magnetisk resonans Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Højfrekvente Ultrasound Imaging af Mouse Cervikal lymfeknuder

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...