Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Bofan Wu et Christian Raithel pour l&#39;assistance technique et Michael Rieger pour son introduction à l&#39;imagerie des cellules vivantes. Soutenu par le NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Réf. 316 (REN), ministère de la Défense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University), grâce à la Fondation Nationale de la Recherche de Corée financé par le ministère de l&#39;Éducation, de la Science et de la Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (matériel de l&#39;usine rongeurs Barrière), et les NIH NCI 5P30CA051008 (microscopie et d&#39;imagerie et des ressources animales partagées).

<html> 1. Schéma général <ol><li> Générer des cultures primaires de cellules épithéliales mammaires précancéreuses de glandes mammaires de génie génétique et de contrôler souris de type sauvage. </li><li> Capturez cellules vivantes images toutes les 15 min en utilisant un logiciel d&#39;acquisition d&#39;image Volocity (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) pour un maximum de 5 jours. </li><li> Voir le time-lapse images directement pour évaluer le calendrier et le mécanisme de la formation de colonies...

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Les étapes critiques Il est important de veiller à ce que les glandes mammaires sont récoltées à partir des souris du même âge à contrôler la variabilité liée à l&#39;âge dans le comportement des cellules épithéliales mammaires. Lorsque l&#39;étalement des cellules, le même nombre de cellules doivent être déposées dans chaque puits pour chaque expérience. Les cellules doivent être relativement rares lorsque le placage de sorte que les cultures ne deviennent confluentes tro...

Modèles de souris génétiquement modifiées sont des outils pour étudier et comprendre comment les différentes lésions génétiques augmentent le risque de développer un cancer du sein. Par exemple, des souris génétiquement modifiées ont montré que la combinaison de trois facteurs: la perte de la poitrine pleine longueur cancer 1, l&#39;apparition précoce (BRCA1) de gènes dans les cellules épithéliales mammaires, la protéine p53 de tumeur (TP53) haplo-insuffisance de la lignée germinale, et épithéliales mammaires cellule ciblée régulation à la hausse alpha récepteurs d&#39;œstrogènes résultats d&#39;expression (EER) dans le développement du cancer mammaire chez 100% des Brca1 floxé (f) Virus 11/f11/Mouse tumeur mammaire (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tétracycline transactivateur (RTTA souris par âge de 12 mois par rapport aux pourcentages inférieurs rapportés dans Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - souris sans ERa sur-expression (~ 50 - 60%) et les souris BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre sans TP53 haploinsufcacité (&lt;5%). 1 Dynamique imagerie time-lapse de la conduite de pré-néoplasiques primaires cellules épithéliales mammaires révèle des différences dans le comportement des cellules qui sont moins facilement apprécié dans des coupes de tissus statiques. Modifications dans la prolifération et la différenciation sont observées dans les cellules mammaires primaires de l&#39;homme porteuses d&#39;une mutation du gène BRCA1. 2 Création d&#39;une seule cellule suspensions primaires de cellules épithéliales mammaires à la normale et des souris génétiquement modifiées sont générés par dissociation enzymatique du tissu réséqué glande mammaire. 3 Time-lapse les images sont vues à évaluer mécanisme de synchronisation et de l&#39;apparence colonie de cellules et l&#39;incidence des modifications morphologiques dans les cellules y compris transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et l&#39;apoptose. Génération de cartes du destin cellulaire, la quantification de la longueur de temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), et la détermination des modes de division cellulaire sont facilitées par l&#39;utilisation d&#39;une seule cellule de suivi. TimmOutil de suivi de l &#39;(TTT) est un logiciel disponible publiquement utilisé pour générer des cartes destin unicellulaires. Son utilité dans la compréhension des mécanismes de destin cellulaire a été établi 4,5 examiner le développement normal de cellules souches hématopoïétiques 6-9 et la génération de neurones. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> EpiCult-B Souris Basal Medium </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-prolifération B Suppléments souris </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinante du facteur de croissance épidermique humain (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase / hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels jetables </td><td> Plume </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> AChlorure mmonium </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um tamis cellulaire </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

En accéléré d&#39;imagerie peut être utilisé pour comparer le comportement de culture primaire des cellules épithéliales mammaires néoplasiques provenant de différents modèles de souris transgéniques de cancer du sein. Par exemple, le temps entre les divisions cellulaires (durée de vie des cellules), le nombre de cellules apoptotiques, l&#39;évolution des changements morphologiques, et le mécanisme de formation de colonies peuvent être quantifiés et comparés dans les cellules portant lésions génétiques spécifiques. Primaires de cellules épithéliales mammaires cultures sont produites par les glandes mammaires sans tumeur palpable. Glandes sont soigneusement réséquée avec une séparation claire de muscle adjacent, les ganglions lymphatiques sont enlevés, et les suspensions monocellulaires de cellules épithéliales mammaires enrichis sont générées par hachage tissu mammaire suivie par dissociation enzymatique et filtration. Simple suspensions de cellules sont ensemencées et placé directement sous un microscope dans une chambre d&#39;incubation pour imagerie des cellules vivantes. Seize 650 um um champs x 700 dans une configuration 4x4 de chaque well d&#39;une plaque à 6 puits sont imagés toutes les 15 minutes pendant 5 jours. Time-lapse images sont directement examinés pour mesurer les comportements cellulaires qui peuvent inclure des mécanismes et la fréquence de la formation de colonies de cellules dans les 24 premières heures d&#39;étalement des cellules (agrégation contre la prolifération des cellules), l&#39;incidence de l&#39;apoptose, et l&#39;échelonnement des changements morphologiques. Une seule cellule de suivi est utilisé pour générer des cartes du destin cellulaire pour la mesure de la durée de vie des cellules individuelles et les enquêtes sur les modèles de division cellulaire. Les données quantitatives sont analysées statistiquement pour évaluer des différences significatives dans le comportement en corrélation avec lésions génétiques spécifiques.

Les cellules épithéliales et fibroblastes peuvent être distingués par la morphologie des cellules. Les cellules épithéliales ont une forme parallélépipédique (figure 1A-B) et forment des colonies de cellules (figure 1A). Fibroblastes, un type de cellules stromales, ont une morphologie allongée (figure 1C). Les cellules ont été arrondies et flottant à l&#39;apparition de l&#39;imagerie (figure 2A-D). Après la fi...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s&#39;il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Recherche

Médecine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

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Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

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Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Méthode pour l&#39;obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d&#39;échantillons solides

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

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Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Suivi Les caractéristiques architecturales mammaires et la détection de cancer du sein avec résonance magnétique Diffusion Tensor Imaging

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High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

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Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...