Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Die Autoren möchten Bofan Wu und Christian Raithel für technische Hilfe und Michael Rieger herzlich für seine Einführung in die Live-Cell-Imaging. Unterstützt durch NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) Programm durch die National Research Foundation of Korea durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (R31-10069) finanziert (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Einrichtung Equipment) und NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopie und Imaging and Animal Freigegebene Ressourcen).

<html> Ein. Insgesamt Scheme <ol><li> Generieren Primärkulturen von präneoplastischen Brustepithelzellen aus Brustdrüsen von gentechnisch hergestellten und zu steuern Wildtyp-Mäusen. </li><li> Nehmen Sie live-cell Bilder alle 15 min mit Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) für bis zu 5 Tagen. </li><li> Erfahren Zeitraffer-Bilder direkt auf Timing und den Mechanismus der Epithelzelle Koloniebildung, Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen beurteile...

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	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Kritische Schritte Es ist wichtig sicherzustellen, dass Brustdrüsen von Mäusen des gleichen Alters für altersbedingte Variabilität Brustepithelzellen Zellverhalten steuern geerntet. Wenn Ausplattieren der Zellen, sollte die gleiche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung zu jedem Experiment plattiert werden. Zellen sollten relativ spärlichen beim Plattieren, so dass Kulturen nicht zu schnell konfluieren die es ermöglichen, mehrere einzelne Zellen durch serielle Bilder folgen. Es ist wichtig,...

Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind Werkzeuge, um zu studieren und zu verstehen, wie verschiedene genetische Läsionen das Risiko an Brustkrebs zu erkranken beitragen. Beispielsweise wurden gentechnisch Mäusen gezeigt, dass die Kombination von drei Faktoren ab: Verlust des Volllängen-Brustkrebs 1, früher Ausbruch (BRCA1) Gens in Brustepithelzellen, Tumor Protein p53 (TP53) Keimbahn Haploinsuffizienz und Brustepithelzellen Zelle gezielt hochreguliert Östrogenrezeptor alpha (ERa) Expression zur Entwicklung von Brustkrebs in 100% der BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( Tet-op) -ER/MMTV-reverse Tetracyclin-Transaktivator (rtTA Mäusen durch Alter von 12 Monaten im Vergleich zu den niedrigeren Prozentsätzen in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 berichteten + / - Mäuse ohne ERa Überexpression (~ 50 - 60%) und BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre Mäuse ohne TP53 haploinsufenz (&lt;5%). 1 Dynamische Zeitraffer-Bildgebung des Verhaltens von präneoplastischen primäre Brustepithelzellen zeigt Unterschiede in Zellverhalten, die weniger leicht in statischen Gewebeschnitte sind erwünscht. Änderungen in der Proliferation und Differenzierung in der primären Mamma-Zellen aus menschlichen BRCA1-Mutation Träger beobachtet. 2 Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen von primären Brustepithelzellen von normalen und gentechnisch veränderten Mäusen durch enzymatische Dissoziation von resezierten Brustdrüsengewebe generiert werden. 3 Zeitraffer Bilder betrachtet werden, um den Mechanismus und den Zeitpunkt der Zellkolonie Aussehen und Auftreten von morphologischen Veränderungen in Zellen, einschließlich epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und Apoptose zu beurteilen. Erzeugung Zellschicksals Karten werden Quantifizierung der Länge der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), und Bestimmung von Mustern der Zellteilung durch Verwendung von Single-Cell-Tracking erleichtert. Timm&#39;S Tracking Tool (TTT) ist öffentlich verfügbaren Software verwendet, um einzelne Zellen Schicksal Karten zu erzeugen. Ihre Nutzbarkeit in der Aufklärung der Mechanismen Zellschicksals wurde festgestellt 4,5 Prüfung normalen hämatopoetischen Stammzelle Entwicklung 6-9 und die Erzeugung von Neuronen. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Maus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Proliferation Supplements Maus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinanten humanen Epidermal Growth Factor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Disposable Scapels </td><td> Feder </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Zeitraffer-Aufnahmen verwendet werden, um das Verhalten von kultivierten primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus verschiedenen gentechnisch veränderten Mausmodellen von Brustkrebs ableiten zu vergleichen. Zum Beispiel kann zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), apoptotischen Zellzahlen, Evolution von morphologischen Veränderungen, und der Mechanismus der Koloniebildung quantifiziert und verglichen werden Zellen, die spezifische genetische Läsionen. Primäre Brustepithelzellen Zellkulturen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor erzeugt. Drüsen sorgfältig mit klare Trennung von angrenzenden Muskels reseziert werden Lymphknoten entfernt, und Einzelzellsuspensionen von angereichertem Brustepithelzellen werden durch Zerkleinern Brustgewebe durch enzymatische Dissoziation und anschließender Filtration erzeugt. Single-Zellsuspensionen ausplattiert und direkt unter dem Mikroskop platziert innerhalb einer Inkubatorkammer für Live-Cell-Imaging. Sixteen 650 um x 700 um Felder in einer 4x4-Konfiguration von jedem well einer 6-Well-Platte werden alle 15 min 5 Tage lang abgebildet. Zeitraffer-Bilder untersucht direkt an zellulären Mechanismus Verhaltensweisen, und die Häufigkeit der Zellkolonie Bildung innerhalb der ersten 24 Stunden der Ausplattieren der Zellen (Aggregation gegenüber Zellproliferation), Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen gehören zu messen. Single-cell-Tracking wird verwendet, um das Schicksal der Zelle Karten für die Messung der einzelnen Zelle Lebensdauer und Untersuchung der Zellteilung Muster zu erzeugen. Quantitative Daten werden statistisch ausgewertet, um auf signifikante Unterschiede im Verhalten mit spezifischen genetischen Läsionen korreliert beurteilen.

Epitheliale und Fibroblasten-Zellen können durch Zellmorphologie unterscheiden. Epithelialen Zellen eine Quaderform (1A-B) und Form Zellkolonien (1A). Fibroblasten, eine Art von Stromazellen, eine längliche Morphologie (Abbildung 1C). Zellen wurden gerundet und schweben zu Beginn der Bildgebung (2A-D). Nach der Befestigung an der Platte wurden sie flach und zeigte eine quaderförmige-Typ Aussehen (2E, H). ...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Forschung

Medizin

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Tracking der Brust architektonische Details und Erkennen von Brustkrebs mit Magnet-Resonanz-Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...