Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Bofan Wu og Christian Raithel for teknisk bistand og Michael Rieger for sin innledning til live-cell imaging. Støttet av NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Facility Equipment), og NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi og Imaging and Animal delte ressurser).

<html> 1. Samlet Scheme <ol><li> Generere primære kulturer av preneoplastic mammary epitelceller fra brystkjertlene ved genmodifisert og kontrollere villtype mus. </li><li> Capture live-celle bilder hver 15 min med Volocity image oppkjøpet programvare (versjon 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) i inntil 5 dager. </li><li> Vis time-lapse bilder direkte å vurdere timing og mekanisme epitelcelleopprinnelse koloni dannelse, forekomst av apoptose, og innfasing av morfologiske endringer. </li><li> Konverter Volocity generer...

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Kritiske trinn Det er viktig å sikre at brystkjertlene høstes fra mus av samme alder å kontrollere for aldersrelatert variasjon i mammary epitelcelleopprinnelse atferd. Når plating cellene, bør samme antall celler bli belagt i hver brønn for hver eksperiment. Celler bør være relativt sparsom når plating slik at kulturer ikke blir sammenflytende altfor raskt gjør det mulig å følge flere individuelle celler gjennom serielle bilder. Det er viktig at platen være ekvilibrert i kuvøse f...

Genmanipulerte mus modeller er verktøy for å studere og forstå hvordan ulike genetiske lesjoner bidrar til risikoen for å utvikle brystkreft. For eksempel har genmanipulerte mus vist at kombinasjonen av tre faktorer: tap av full-lengde bryst 1 kreft, tidlig debut (BRCA1) genet i mammary epitelceller, tumor protein p53 (TP53) bakterie-linje haploinsufficiency og mammary epitelial celle målrettet opp-regulert Østrogen reseptor alfa (ERA) uttrykk resultater i utviklingen av mammary kreft i 100% av BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyklin transactivator (rtTA mus ved 12 måneders alder i forhold til de lavere prosenter rapportert i BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - mus uten ERA over-uttrykk (~ 50 - 60%) og BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre mus uten TP53 haploinsufficiency (&lt;5%). 1 Dynamisk time-lapse avbildning av oppførselen preneoplastic primære mammary epitelceller avslører forskjeller i celle atferd som er mindre lett verdsatt i statiske vevsdelene. Endringer i spredning og differensiering er observert i primære mammary celler fra menneskelige BRCA1 mutasjon bærere. 2 Opprettelse av encellede suspensjoner av primære mammary epitelceller fra normal og genmanipulerte mus genereres gjennom enzymatisk disassociation av resected melkekjertlene. 3 Time-lapse Bildene er vist å vurdere mekanisme og timing av celle koloni utseende og forekomst av morfologiske endringer i celler, inkludert epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og apoptose. Generering av celle skjebne kartene blir kvantifisering av lengden av tiden mellom celledelinger (celle levetid), og bestemmelse av mønstre av celledeling tilrettelagt av bruk av encellede sporing. Timm&#39;S Sporing Tool (TTT) er offentlig tilgjengelig programvare som brukes til å generere encellede skjebne kart. Sin nytteverdi i belyse mekanismer celle skjebne er etablert 4,5 undersøke normale hematopoetisk stamcelle utvikling 6-9 og generering av nerveceller. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på Reagens </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B spredning Kosttilskudd Mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinant human epidermal vekstfaktor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Disponibel Scapels </td><td> Feather </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 mikrometer celle sil </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Time-lapse imaging kan brukes til å sammenligne oppførselen dyrkede primære preneoplastic mammary epitelceller utledet fra forskjellige genmanipulerte musemodeller av brystkreft. For eksempel kan tiden mellom celledelinger (celle levetid), apoptotiske celler tall, utviklingen av morfologiske endringer, og mekanismen av kolonien formasjon kvantifiseres og sammenlignes i celler som bærer spesifikke genetiske forandringer. Primære mammary epitel cellekulturer blir generert fra brystkjertlene uten håndgripelig svulst. Kjertler er nøye resected med klart skille fra tilstøtende muskel, blir lymfeknutene fjernet, og encellede suspensjoner av beriket mammary epitelceller genereres av hakking mammary vev etterfulgt av enzymatisk dissosiasjon og filtrering. Encellede suspensjoner er belagt og plassert direkte under et mikroskop innenfor en inkubator kammer for live-cell imaging. Seksten 650 mikrometer x 700 mikrometer felt i en 4x4-konfigurasjon fra hver well av en 6-brønns plate er avbildes hvert 15 min i 5 dager. Time-lapse bilder er undersøkt direkte å måle mobilnettet atferd som kan inkludere mekanisme og hyppigheten av celle koloni formasjon innenfor de første 24 hr av plating cellene (aggregering versus celledeling), forekomst av apoptose, og innfasing av morfologiske endringer. Encellede sporing brukes til å generere celle skjebne kart for måling av individuelle celle levetid og etterforskning av celledeling mønstre. Kvantitative data er statistisk analysert for å vurdere for betydelige forskjeller i oppførsel korrelert med spesifikke genetiske lesjoner.

Epiteliale og fibroblast celler kan være preget av celle morfologi. Epitelceller har en kubisk form (figur 1A-B) og danner celle kolonier (figur 1A). Fibroblaster, en type stromal celle, har en langstrakt morfologi (figur 1C). Celler ble avrundet og flyter på utbruddet av imaging (figur 2A-D). Etter tilknytning til platen ble de flat og viste en kubisk-attraksjon utseende (figur 2E, H). Av 4 dager med kult...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse bildebehandling brukes til å vurdere oppførselen primære preneoplastic mammary epitelceller avledet fra genmanipulerte mus modeller av risikoen for brystkreft for å avgjøre om det er sammenhenger mellom spesifikke atferdsmessige parametere og distinkte genetiske lesjoner.

Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Eksperimentell Generation of Karsinom-Associated Fibroblaster (kafeer) fra Human mammary Fibroblaster

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Lever Imaging of Drug Responses i svulsten mikromiljøet i musemodeller av Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Metode for Innhenting av primær eggstokkreft celler fra solide Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Orthotopic Injeksjon av brystkreft celler inn i Mammary Fat Pad av mus å studere tumorvekst.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Spore Bryst Arkitektoniske funksjoner og oppdage brystkreft med Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Høyfrekvente ultralydavbildning av Muse Cervical lymfeknuter

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En organotypiske høy gjennomstrømning System for Karakterisering av Drug Sensitivity of Primary myelomatose Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...