Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Os autores agradecem a Bofan Wu e Christian Raithel de assistência técnica e Rieger Michael para a sua introdução para live-célula de imagem. Apoiado pelo NCI, RO1CA112176 NIH (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Departamento de Defesa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU programa (World Class University), através da Fundação de Pesquisa Nacional da Coreia, financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Roedor Equipamentos Facilidade Barreira), e NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopia e Imagem e Animal Recursos Compartilhados).

<html> 1. Esquema geral <ol><li> Gerar culturas primárias de células epiteliais mamarias pré-neoplásicas de glândulas mamárias de engenharia genética e de controlar a ratinhos de tipo selvagem. </li><li> Capturar imagens ao vivo de células a cada 15 minutos utilizando Volocity software de aquisição de imagem (versão 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) para um máximo de 5 dias. </li><li> Ver lapso de tempo imagens diretamente para avaliar tempo e mecanismo de formação das células epiteliais colônia, a incid...

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Etapas críticas É importante assegurar que as glândulas mamárias são colhidas a partir de ratos da mesma idade para controlar a variabilidade relacionada com a idade no comportamento da célula epitelial mamaria. Quando plaqueamento das células, o mesmo número de células devem ser semeadas em cada poço de cada experimento. As células devem ser relativamente esparsa quando plaqueamento de modo a que as culturas não se tornam confluentes muito rapidamente tornando-se possível seguir v...

Modelos de ratos geneticamente modificados são ferramentas para estudar e entender como diferentes lesões genéticas contribuem para o risco de desenvolver câncer de mama. Por exemplo, ratos geneticamente modificados demonstraram que a combinação de três factores: a perda da mama de comprimento completo cancro 1, o início precoce (BRCA1) gene em células epiteliais mamarias, a proteína p53 do tumor (TP53) da linha germinal haploinsuficiência, e epitelial mamaria célula alvo-regulada alfa do receptor de estrogénio (ERa) resultados de expressão no desenvolvimento de cancro da mama em 100% de BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse vírus do tumor mamário (MMTV) -Cre/p53 -/tetracycline-operator + / ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transativador (camundongos rtTA por 12 meses de idade, em comparação com as percentagens mais baixas relatadas em BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ratos sem ERa sobre-expressão (~ 50 - 60%) e ratos BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre sem TP53 haploinsufência (&lt;5%) 1. Imagiologia de lapso de tempo dinâmico do comportamento de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias revela diferenças no comportamento de células que são menos facilmente apreciados em secções de tecido de estática. Alterações na proliferação e diferenciação são observados nos principais células mamárias de portadores da mutação BRCA1 humanos. 2 Criação de uma única célula suspensões de células epiteliais mamárias primárias do normal e ratos geneticamente modificados são gerados através de dissociação enzimática de ressecado tecido da glândula mamária. 3 Time-lapse as imagens são vistas mecanismo para avaliar e tempo de aparecimento de células colônia e incidência de alterações morfológicas em células incluindo transição epitelial-mesenquimal (EMT) e apoptose. Geração de mapas de destino celular, a quantificação da duração de tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células), e determinação de padrões de divisão celular são facilitadas pela utilização de uma única célula de controlo. TimmFerramenta de Acompanhamento &#39;s (TTT) é um software disponível publicamente usada para gerar mapas de uma única célula destino. A sua utilidade na elucidação dos mecanismos de destino celular foi estabelecida a 4,5 examinar o desenvolvimento normal das células-tronco hematopoiéticas 6-9 e a geração de neurônios 10.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> EpiCult B-Rato Meio Basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Proliferação Rato Suplementos </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinante fator de crescimento epidérmico humano (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase / Hialuronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels descartáveis </td><td> Pena </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hanks </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> ACloreto mmonium </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 filtro de células mM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Lapso de tempo de imagem pode ser utilizada para comparar o comportamento de culturas primárias células epiteliais mamarias pré-neoplásicas derivadas de diferentes modelos de ratos geneticamente modificados de cancro da mama. Por exemplo, o tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células), os números de células apoptóticas, a evolução de alterações morfológicas, e mecanismo de formação de colónias pode ser quantificada e comparada em células portadoras de lesões genéticas específicas. Primários mamárias culturas de células epiteliais são gerados a partir de glândulas mamarias sem tumor palpável. Glândulas são cuidadosamente ressecada com clara separação de músculo adjacente, os nódulos linfáticos são removidas, e as suspensões de célula única de células epiteliais mamárias enriquecidos são gerados pelo tecido mamário trituração seguida por dissociação enzimática e filtração. Unicelulares suspensões são banhados e colocado diretamente sob um microscópio dentro de uma câmara incubadora para live-célula de imagem. Dezasseis 650 x 700 uM campos uM numa configuração 4x4 de cada well de uma placa de 6 poços são gravadas a cada 15 min, durante 5 dias. Lapso de tempo imagens são examinados diretamente para medir comportamentos celulares que podem incluir mecanismo ea freqüência de formação de colônias de células dentro da 24 hora antes de plaqueamento as células (agregação contra a proliferação de células), a incidência de apoptose, e faseamento de alterações morfológicas. De uma única célula de rastreamento é utilizada para gerar mapas de células destino para a medição de tempos de vida de células individuais e investigação de padrões de divisão celular. Os dados quantitativos foram analisados ​​estatisticamente para determinar as diferenças significativas no comportamento correlacionados com lesões genéticas.

As células epiteliais e de fibroblastos podem ser distinguidos pela morfologia celular. As células epiteliais tem uma forma cuboidal (Figura 1A-B) e formam colónias de células (Figura 1A). Fibroblastos, um tipo de células do estroma, têm uma morfologia alongada (Figura 1C). As células foram reunidas e flutuando no início da imagiologia (Figura 2A-D). Após a ligação à placa plana e tornaram-se demonstrado um aspec...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

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Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Medicina

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

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Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Acompanhando as mamárias elementos arquitectónicos e detecção do câncer de mama com Ressonância Magnética Tensor Difusão de imagens

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

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Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

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