Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
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Los autores desean agradecer a Bofan Wu y Raithel cristiana de asistencia técnica y Michael Rieger para su introducción a imágenes de células vivas. Apoyado por el NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN) del Departamento de Defensa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (R31-10069) (PAF ), NIH RR025828 GI20-01 (barrera contra roedores equipos de la instalación) y NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopía e Imagen y Recursos Compartidos Animal).

<html> 1. Esquema General <ol><li> Generar cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas de las glándulas mamarias de animales diseñados genéticamente y controlar ratones de tipo salvaje. </li><li> Captura de imágenes en vivo de células cada 15 minutos utilizando la imagen Volocity software de adquisición (versión 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) durante un máximo de 5 días. </li><li> Ver time-lapse imágenes directamente a evaluar el tiempo y el mecanismo de formación de colonias de cé...

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	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Los pasos críticos Es importante asegurarse de que las glándulas mamarias se cosechan a partir de ratones de la misma edad de controlar por edad relacionados con la variabilidad en el comportamiento de células epiteliales mamarias. Cuando en placas las células, el mismo número de células se deben sembraron en cada pocillo para cada experimento. Las células deben ser relativamente escasa cuando enchapado, de modo que las culturas no se hacen confluentes demasiado rápido por lo que es pos...

Genéticamente modificados modelos de ratón son herramientas para estudiar y entender cómo diferentes lesiones genéticas que contribuyen al riesgo de desarrollar cáncer de mama. Por ejemplo, los ratones transgénicos han demostrado que la combinación de tres factores: la pérdida de la mama de longitud completa cáncer 1, inicio temprano (BRCA1) de genes en células epiteliales mamarias, la proteína p53 tumor (TP53) de la línea germinal haploinsuficiencia, y epiteliales mamarias célula diana hasta reguladas estrógeno receptor alfa (EEI) los resultados de expresión en el desarrollo del cáncer de mama en el 100% de los genes BRCA1 floxed (f) Virus 11/f11/Mouse tumor mamario (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transactivador (rtTA ratones a los 12 meses de edad en comparación con los porcentajes más bajos reportados en Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ratones sin ERa sobre-expresión (~ 50 - 60%) y BRCA1 ratones f11/f11/MMTV-Cre sin Tp53 haploinsufdeficiencia (&lt;5%). 1 Dinámica de lapso de tiempo de imagen del comportamiento de preneoplásicas células epiteliales primarias mamarias revela diferencias en el comportamiento de las células que son menos fácilmente apreciadas en secciones de tejido estáticas. Las alteraciones en la proliferación y la diferenciación se observan en células primarias mamarias de humanos portadores de mutaciones BRCA1. 2 Creación de una sola célula suspensiones de células primarias epiteliales mamarias normales y de ratones transgénicos se generan a través de la disociación enzimática de tejido extirpado la glándula mamaria. 3 Time-lapse imágenes se ven a evaluar mecanismo y el momento de aparición de células colonia y la incidencia de los cambios morfológicos en las células, incluyendo epitelio-mesenquimal transición (EMT) y la apoptosis. Generación de mapas de destino celular, la cuantificación de la longitud de tiempo entre las divisiones celulares (tiempos de vida de células), y la determinación de los patrones de división celular se facilita por el uso de una sola célula de seguimiento. TimmHerramienta de Seguimiento &#39;s (TTT) es un software a disposición del público para generar una sola célula de mapas de destino. Su utilidad en la elucidación de mecanismos de destino de la célula se ha establecido 4,5 examinar el desarrollo normal de células madre hematopoyéticas 6-9 y la generación de neuronas. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> EpiCult-B de ratón Basal Medium </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Suplementos proliferación del ratón </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinante Factor de crecimiento epidérmico humano (EGFhr) </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa / hialuronidasa </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels desechables </td><td> Pluma </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Lammonium Chloride </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 filtro de células micras </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Imagen de lapso de tiempo se puede usar para comparar el comportamiento de cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas derivados de los diferentes modelos de ratón genéticamente modificadas de cáncer de mama. Por ejemplo, el tiempo entre las divisiones celulares (móviles vidas), números de células apoptóticas, la evolución de los cambios morfológicos, y el mecanismo de formación de colonias pueden ser cuantificados y comparados en las células que transportan determinadas lesiones genéticas. Cultivos primarios de células epiteliales mamarias se generan a partir de glándulas mamarias sin tumor palpable. Glándulas son cuidadosamente resecado con clara separación de músculo adyacente, se extraen ganglios linfáticos, y solo suspensiones de células enriquecidas de células epiteliales mamarias se generan por el tejido mamario de picar carne seguido por disociación enzimática y filtración. Solo suspensiones de células se colocan en placas y se coloca directamente bajo un microscopio en una cámara incubadora para vivo de células de imágenes. Dieciséis 650 micras x 700 micras campos en una configuración 4x4 de cada well de una placa de 6-así se crean imágenes cada 15 minutos durante 5 días. Lapso de tiempo imágenes son examinados directamente para medir los comportamientos celulares que pueden incluir mecanismo y frecuencia de formación de colonia de células dentro de las primeras 24 horas de placas las células (agregación frente a la proliferación celular), la incidencia de la apoptosis, y la eliminación gradual de los cambios morfológicos. Una sola célula de seguimiento se utiliza para generar mapas de destino celular para la medición de tiempos de vida de células individuales y la investigación de los patrones de división celular. Los datos cuantitativos se analizaron estadísticamente para evaluar las diferencias significativas en el comportamiento correlacionado con determinadas lesiones genéticas.

Las células epiteliales y fibroblastos se pueden distinguir por la morfología celular. Las células epiteliales tienen una forma cuboide (Figura 1A-B) y forman colonias de células (Figura 1A). Los fibroblastos, un tipo de células del estroma, tienen una morfología alargada (Figura 1C). Las células se redondean y flotando en el inicio de la formación de imágenes (Figura 2A-D). Después de la unión a la placa plana y ...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

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Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Investigación

Medicina

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

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Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

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Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

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