Name: time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Författarna vill tacka Bofan Wu och Christian Raithel för tekniskt bistånd och Michael Rieger för hans introduktion till levande cell imaging. Med stöd av NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), försvarsdepartementet W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) program genom National Research Foundation of Korea finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (R31-10.069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Facility Equipment), och NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi och Imaging och djurhälsa delade resurser).

<html> 1. Övergripande system <ol><li> Generera primära kulturer av preneoplastiska bröstepitelialceller celler från mjölkkörtlar hos genetiskt modifierade och styra vildtypsmöss. </li><li> Fånga levande cellbilder varje 15 min med Volocity programvara bildtagning (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) i upp till 5 dagar. </li><li> Visa tidsfördröjda bilder direkt bedöma timing och mekanismen för epitelceller kolonibildning, förekomst av apoptos, och utfasning av morfologiska förändringar. </li><li> K...

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Kritiska steg Det är viktigt att se till att bröstkörtlar skördas från möss av samma ålder för att kontrollera åldersrelaterad variation i bröstepitelialceller cellbeteende. När utstrykning av cellerna, bör samma antal celler pläteras i varje brunn för varje försök. Celler bör vara relativt glesa när plätering så att kulturerna inte blir konfluenta alltför snabbt gör det möjligt att följa flera enskilda celler genom seriella bilderna. Det är viktigt att plattan är jäm...

Genetiskt modifierade musmodeller är verktyg för att studera och förstå hur olika genetiska skador bidrar till risken att utveckla bröstcancer. Till exempel, har genetiskt modifierade möss visat att kombinationen av tre faktorer: förlust av fullständig längd bröstcancer 1, tidig debut (BRCA1) genen i mammära epitelceller, tumör p53 (TP53) könslinjen haploinsufficiency, och bröstepitelialceller cell riktade uppreglerad Östrogenreceptor alfa (ERA) uttryck resulterar i utvecklingen av bröstcancer i 100% av BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse mammartumörvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyklin transaktivator (rtTA möss med 12 månaders ålder i jämförelse med de lägre procenttal som redovisas i BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - möss utan ERA överuttryck (~ 50 - 60%) och BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre möss utan TP53 haploinsuftivitet (&lt;5%). 1 Dynamisk time-lapse avbildning av beteendet hos preneoplastiska primära bröst epitelceller avslöjar skillnader i cell beteende som är mindre lätt uppskattas i statiska vävnadssnitt. Förändringar i proliferation och differentiering observeras i primära mammarceller från mänskliga bärare BRCA1 mutation. 2 Skapande av encelliga suspensioner av primära bröst epitelceller från normala och genetiskt modifierade möss genereras genom enzymatisk dissociation av resekerade bröstkörtelvävnaden. 3 Time-lapse bilderna ses att bedöma mekanismen och tidpunkten för cell-kolonin utseende och förekomsten av morfologiska förändringar i celler, inklusive epitel-mesenkymala övergång (EMT) och apoptos. Generering av kartor cellöde, är kvantifiering av längden av tiden mellan celldelningar (cell livstider), och bestämning av mönster av celldelning underlättas genom användning av encelliga spårning. TimmS verktyg för spårning (TTT) är allmänt tillgänglig programvara som används för att generera encelliga öde kartor. Dess användbarhet för att belysa mekanismerna för cellens öde har fastställts 4,5 undersöka normala hematopoetisk utveckling stamceller 6-9 och generering av neuroner. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Mus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05.610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B proliferation Kosttillskott Mus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05.612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02.633 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenas / Hyaluronidas </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.912 </td><td></td></tr><tr><td> Disponibel Scapels </td><td> Fjäder </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanserade saltlösning </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37.150 </td><td></td></tr><tr><td> ENmmonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispas </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.913 </td><td></td></tr><tr><td> DNas I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07.900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 | im cellfilter </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27.305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06.100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15.140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Time-lapse avbildning kan användas för att jämföra beteendet hos odlade primära preneoplastiska bröst epitelceller som härstammar från olika genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer. Till exempel kan tiden mellan celldelningar (cell livslängd), apoptotiska cellantal, utvecklingen av morfologiska förändringar och mekanism av kolonibildning kvantifieras och jämföras i celler som bär specifika genetiska skador. Primära bröstepitelialceller cellkulturer genereras från mjölkkörtlar utan påtaglig tumör. Körtlar noggrant opererande med tydlig separation från angränsande muskler, är lymfkörtlar bort och encelliga suspensioner av anrikad bröst epitelceller genereras av hackning bröstvävnad följt av enzymatisk dissociation och filtrering. Encelliga suspensioner pläterade och placeras direkt under ett mikroskop i en inkubator kammare för levande cell imaging. Sexton 650 nm x 700 nm fält i en 4x4-konfiguration från varje vell av en 6-brunnsplatta avbildas varje 15 min under 5 dagar. Tidsfördröjda bilder undersöks direkt för att mäta cellulära beteenden som kan innefatta mekanism och frekvens av cell kolonibildning inom de första 24 h av utstrykning av cellerna (aggregering kontra cellproliferation), förekomst av apoptos, och fördelningen av morfologiska förändringar. Encelliga spårning används för att generera kartor cellöde för mätning av enskilda celler livslängd och utredning av mönster celldelning. Kvantitativa data statistiskt analyserats för att fastställa om signifikanta skillnader i beteende korrelerade med specifika genetiska skador.

Epiteliala och fibroblastceller kan särskiljas genom cellmorfologi. Epitelceller har en kubformig form (fig. 1A-B) och bildar kolonier cell (Figur 1A). Fibroblaster, en typ av stromal, har en långsträckt morfologi (figur 1C). Celler rundade och flytande vid början av avbildning (Figur 2A-D). Efter fastsättning till plattan blev platt och visade en kubformigt-typ utseende (figur 2E, H). Med 4 dagars odli...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning används för att bedöma beteendet hos primära preneoplastiska bröst epitelceller från den genetiskt modifierade musmodeller av risken för bröstcancer för att avgöra om det finns samband mellan specifika beteendemässiga parametrar och distinkta genetiska skador.

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescence avbildning av tumör Hypoxi Dynamics i bröstcancer metastaser i hjärnan i en musmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentell generationens Cancer Associated-fibroblasts (CAFS) från Human bröst fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Realtidsundersökningen av Drug svar i tumören mikromiljön i musmodeller av bröstcancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av östrogenreglerade MicroRNAs i bröstcancerceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Metod för att erhålla primär äggstockscancerceller från Solid Prover

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Orthotopic Injektion av bröstcancerceller i juverfett Pad av möss att studera tumörtillväxt.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Spårning bröst arkitektoniska särdrag och upptäcka bröstcancer med Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Högfrekvent ultraljud avbildning av Mouse Cervical lymfkörtlar

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...