Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Forfatterne takker Prof. M. Dietel og Dirk Schumacher for at støtte dette arbejde og kritisk læsning af manuskriptet. Den forskning, der fører til disse resultater har modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende under tilskudsaftale nr. 115.234, ressourcer, som er sammensat af tilskud fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA virksomheder &quot;i naturaliebidrag. Dette arbejde blev også støttet af Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Den generelle opbygning af forsøget, herunder fremstillingen af primære single-celler fra tumorvæv, karakterisering af den primære cellekultur, fibroblast udtømning og magnetisk cellesortering af CD133 + og CD133 - melanomceller er vist i figur 1.. 1. Prøveindsamling <ol><li> Check for etisk godkendelse, før man overvejer de næste skridt. </li><li> Forbered en 50 ml rør med steril PBS suppleret med 1% penicillin-streptomycin endelig koncentra...

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

For at fjerne erythrocyt forureninger fra tumor cellepellet vi stærkt anbefale at bruge den røde blodlegemer lyseopløsning fra Miltenyi. Fordelene ved lysering af erythrocytterne via det traditionelle Ficoll densitetsgradientcentrifugering er, at den er hurtigere og enklere. Endvidere er kontaminering med Ficoll eller røde blodlegemer og tab af tumorceller undgås. Når du observere væksten af ​​fibroblaster i den primære cellekultur de bør fjernes straks, da de normalt overgrow tumorcellerne når man venter ...

Kutane maligne melanomer er den mindst udbredte, men mest dødbringende form for hudkræft. På grund af en stigende forekomst, en høj grad af malignitet og en hurtig formidling, melanomer nu tegner sig for 75% af maligne hudtumorer dødsfald 1,2. Udover kirurgisk excision af den primære tumor, kemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombineret kemo-og immunterapi af metastaseret melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling 3,4. Imidlertid er malignt melanom karakteriseret ved en dårlig respons på kemoterapi (5-12%) 5,6, og kun de 50-70% af melanompatienter bærer BRAF V600E genmutation gavn af lovende nye målrettede behandlinger som behandling med vemurafenib 7 Til forbedre den samlede overlevelse, er en langt bedre forståelse af mekanismerne bag melanom tumorigenese nødvendig. For at studere disse mekanismer tidligere, veletablerede kommerciellecielt tilgængelige cellelinier blev anvendt. Nyere metoder til at studere de molekylære begivenheder i kræft initiering og progression udnytte primære kulturer afledt direkte fra tumorvæv - en strategi bærer mangfoldige fordele: Forskeren har fuld kontrol over patient og væv udvælgelse. I stikprøven celler opnået fra sagkyndigt valgt tumorvæv, ligner tumoren med alle dets heterogenitet og opfølgningsdata af patientens behov og en detaljeret patologi er tilgængelig til at tillade karakteristika af kulturen, der skal sammenlignes med den oprindelige tumor 8. I modsætning hertil er anvendelsen af ​​etablerede cellelinjer som relevante modelsystemer i kræftforskning diskuteret kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kolleger beskrevne signifikante biologiske forskelle mellem MCF-7 humane brystcancercellelinjer fra forskellige laboratorier 9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variation i RNA-ekspression i løbet af subkultur var confirmed ved Hiorns et al. og forudsat understøttende data for dokumentation for, at cellelinier ikke udvikler sig i kulturen og dermed svække den direkte relevans af sådanne etablerede kulturer som modeller for humane cancer 10. En anden vigtig overvejelse, som er stort set blevet ignoreret i årenes løb, er risikoen for forurening eller tilgroning af kulturer med uafhængige &quot;falske&quot; celler, som først fremhævede over tyve år siden ved at demonstrere, at en lang række cellelinier blev inficeret med HeLa celler 8,11. Fejlfortolkning af data fra &quot;falske&quot; cellelinjer er for nylig kommet frem i litteraturen igen. Under anvendelse af en kombination af DNA-profilering og molekylær cytogenetik, afslørede MacLeod et al. Den for 252 nye tumorafledte humane cellelinjer deponeret hos den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), næsten 18% blev fundet at være intraspecies eller interspecies cross -kontaminanter 12,13. For at undgå disse problemer og at gøre brug af de fordele, der er nævnt ovenfor, besluttede vi at etablere lav-passage melanomcellelinjer fra frisk udtaget metastaser. Robuste celleadskillende og analyse teknologier kræver encellede forberedelser, der skal genereres samtidig begrænser celledød og ødelæggelse af karakteristiske overfladeproteiner. En benchtop instrument til automatiseret dissociation af væv i single-cellesuspensioner er gentleMACS Dissociator fremstillet af Miltenyi. Ved anvendelse i kombination med gentleMACS C Tubes og optimeret dissociation opløsninger, en effektiv og skånsom dissociering af tumorvæv i et lukket system opnås samtidig bevare antigen-epitoper og reducere celletab. Instrumentet tilbyder optimerede, forudindstillede programmer til en række specifikke applikationer og garantier standardiseret udarbejdelse af enkelt-cellesuspensioner fra melanomavæv 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nylige rapporter viste, at størstedelen af ​​tumorer huser en lille subpopulation af såkaldte cancer stamceller (specificitetsattestering), som udelukkende udviser tumorfremkaldende og selvfornyende kapacitet. Identifikationen af melanocyt-producerende stamceller i dermis af huden førte til den hypotese, at disse celler kan være oprindelsen af cancer stamceller (specificitetsattestering) i melanom, da eksponering for UVA-stråling kan prime disse celler for malign transformation 15. Resultatet af en sådan genetisk læsion vil være celler, der huser en kombination af tumor og stamceller egenskaber. En af de vigtigste markører foreslået at repræsentere subpopulation af specificitetsattestering i melanom er CD133 16-20. CD133 (også kendt som Prominin 1), et medlem af pentaspan transmembrane glycoproteiner, der er udtrykt i hæmatopoietiske stamceller, endoteliale stamceller, neuronale og gliale stamceller 21-23. Ekspression af CD133 er korreleret medasymmetrisk celledeling 24, og den glycosylerede epitop af CD133 blev vist at være nedreguleret ved celledifferentiering 25. For nylig blev CD133 + melanomceller vist at have selvfornyelse og tumor-initiering kapacitet 19,20. At studere funktionen af CD133 + putative melanom specificitetsattestering har vi modificeret og optimeret Magnetic cellesortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech at opnå meget beriget og levedygtige populationer af CD133 + og CD133 - celler. Magnetisk perle-baseret celleseparation tillader enten negativ selektion som vist ved MATHEU et al. 26 eller positiv selektion som vi viser her. Under positiv selektion den særlige målcelletype, f.eks CD133 udtrykkende celler, er magnetisk mærket med mikroperler, 50 nm superparamagnetiske partikler, der er konjugeret til meget specifikke antistoffer mod etsærligt celleoverfladeantigen. Under adskillelsen er de magnetisk mærkede celler tilbageholdes i kolonnen i det magnetiske felt af separatoren, mens umærkede celler strømme igennem. Efter vasketrin, søjlen fjernes fra det magnetiske felt af separatoren, og målcellerne elueres fra søjlen. LS eller MS kolonner anvendes under positiv selektion resulterer i fraktioner af mærkede og umærkede celler med høj renhed. På den anden side,. LD søjler, der anvendes til negativ selektion, resulterer i en lidt lavere renhed af det mærkede fraktion På grund af den tættere pakning af deres matrix strømningshastigheden i disse kolonner er lavere resulterende i en øget risiko for umærkede celler, der skal fanges i kolonnen. LD kolonner bør derfor kun anvendes til stringent udtømning af en uønsket cellesubpopulation. Positiv selektion kan udføres ved direkte (antistof koblet til mikrokugler) eller indirekte magnetiske mærkning (inkubation med mikrokugler efter incubation med det primære antistof). Specifikke MACS-mikroperler er tilgængelige til positiv selektion af talrige celletyper af primære tumorceller såsom prostatahypertrofi eller melanoma 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B-opløsning 250 g / ml i deioniseret vand </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblaster mikroperler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> APPLICHEM GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS uden Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Dinatriumethyltendiamintetracetat dehydrerer (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirekte CD133 Micro-Bead Kit human </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Indeholder: CD133 / 1 (AC133)-biotin, anti-biotin mikroperler og FcR blokeringsreagens </td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin, væske (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Blood Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Udstyr </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell si (70 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Multi Stand </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS seperation Kolonner 25 LS Kolonner </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tube Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567.440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Forseparering filtre </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-sprøjtefiltre (0,22 um, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filter Unit 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Trods forbedrede behandlinger muligheder for melanom rådighed i dag, stadig patienter med fremskreden malignt melanom har en dårlig prognose for progressionsfri og samlet overlevelse. Derfor translationel forskning skal give yderligere molekylære beviser til at forbedre målrettede behandlinger for maligne melanomer. I fortiden, onkogene mekanismer relateret til melanom blev grundigt undersøgt i etablerede cellelinjer. På vej til mere individualiserede behandlingsplaner baseret på individuelle genetiske profiler, foreslår vi at bruge patient-afledte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høj kvalitet kliniske data, især på patient opfølgning, vil disse celler være medvirkende til bedre at forstå de molekylære mekanismer bag melanom progression. Her rapporterer vi etablering af primære melanom kulturer fra dissekeret friske vævsprøver. Denne procedure omfatter hakning og dissociation af vævet i enkelte celler, removal af forureninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålidelig kontrol af cellernes melanom oprindelse. Nylige rapporter viste, at melanomer, ligesom størstedelen af ​​tumorer. Havnen en lille subpopulation af kræft stamceller (specificitetsattestering), der synes at udelukkende brændstof tumor initiering og progression mod metastatisk stadie En af de vigtigste markører for CSC identifikation og isolation i melanom er CD133. For at isolere CD133 + specificitetsattestering fra primære melanom kulturer, har vi ændret og optimeret Magnetic cellesortering (MACS) procedure fra Miltenyi resulterer i høj sortering renhed og levedygtighed CD133 + specificitetsattestering og CD133 - bulk, som kan dyrkes og funktionelt analyseret derefter.

Fremstilling af enkelt-celler fra tumorvæv Figur 2 eksemplificerer en resekteret lymfeknude metastase af en sen fase melanom patient før (A) og efter (B) mekanisk dissociering i 2-4 mm stykker. Efter enzymatisk dissociering af væv og filtrering gennem en 70 um nylon mesh, blev cellerne pelleteret og supernatanten kasseres. I dette trin vi observeret en stærk forurening med erythrocytter som angivet ved den rødlige farve af cellepelleten i figur 2C. Efterf?...

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

I denne artikel beskriver fremstillingen af ​​frisk opnåede melanomavæv i primære cellekulturer, og hvordan du fjerner forureninger af erythrocytter og fibroblaster fra tumorcellerne. Endelig beskriver vi, hvordan CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putative melanom stamceller sorteres fra CD133<sup&gt; -</sup&gt; Hovedparten anvendelse af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS).

Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133<sup&gt; +</sup&gt; Formodede kræftstamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering af cardiomyocyte Kerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berigelse for kemoterapi kræft i æggestokkene stamceller fra humane cellelinier

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolering og Immortalisering af Patient-afledte cellelinjer fra muskelbiopsi for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kvantitativ Massespektrometrisk profilering kræft-celle proteomer arvet fra flydende og faste tumorer

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering og dyrkning Udvidelse af Tumorspecifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...