Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

De auteurs danken prof. dr. M. Dietel en Dirk Schumacher voor de ondersteuning van dit werk en het kritisch lezen van het manuscript. Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft steun gekregen van het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst nr. 115234, middelen waarvan van de financiële bijdrage bestaat uit Zevende Kaderprogramma van de Europese Unie (FP7/2007-2013) en EFPIA ondernemingen &quot;in soort bijdrage. Dit werk werd ondersteund door de Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

De opzet van het experiment met inbegrip van de vervaardiging van primaire single-cellen van tumorweefsel, karakterisering van het primaire celkweek, fibroblast uitputting en magnetische celsortering van CD133 + en CD133 - melanoomcellen wordt getoond in Figuur 1. 1. Afnemen van het monster <ol><li> Controleer op ethische goedkeuring alvorens te overwegen de volgende stappen. </li><li> Bereid een 50 ml buis met steriele PBS aangevuld met 1% penicillin...

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

Om erythrocyten verontreinigingen uit de tumorcel pellet raden wij de rode bloedcel lysisoplossing van Miltenyi. De voordelen van het lyseren van de erytrocyten in de traditionele Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugeren worden dat het sneller en eenvoudiger. Bovendien worden verontreinigingen met Ficoll of rode bloedcellen en het verlies van tumorcellen vermeden. Wanneer u de groei van fibroblasten in de primaire celcultuur in acht moeten ze onmiddellijk worden verwijderd omdat zij normaal gesproken overwoekeren de tum...

Cutane maligne melanomen zijn het minst vaak voor, maar de meeste dodelijke vorm van huidkanker. Als gevolg van een toenemende incidentie, een hoge graad van maligniteit en een snelle verspreiding, melanomen nu goed voor 75% van de kwaadaardige huidtumoren sterfgevallen 1,2. Naast chirurgische excisie van de primaire tumor, chemotherapie, radiotherapie, immunotherapie en gecombineerde chemo-en immunotherapie van uitgezaaid melanoom zijn de state-of-the-art strategieën voor melanoom behandeling 3,4. Echter, maligne melanoom gekenmerkt door een slechte reactie op chemotherapeutica (5-12%) 5,6, en alleen die 50-70% van melanoompatiënten het dragen van de BRAF V600E genmutatie profiteren van veelbelovende nieuwe gerichte therapieën als behandeling met vemurafenib 7 Om verbetering van de totale overleving, is een veel beter begrip van de mechanismen van melanomen ontstaan ​​van tumoren nodig. Om deze mechanismen te bestuderen in het verleden, gevestigde commerciëleverkrijgbare cellijnen werden gebruikt. Meer recente benaderingen van de moleculaire gebeurtenissen van het ontstaan ​​van kanker en progressie te bestuderen gebruiken primaire culturen direct afgeleid van tumorweefsel - een strategie lager vele voordelen: De onderzoeker heeft volledige controle van de patiënt en weefsel selectie. De bemonsterde cellen verkregen van goed gekozen tumorweefsel, lijken de tumor met de heterogeniteit en de follow-up data van de patiënt en een gedetailleerde pathologie is om de karakteristieken van de cultuur worden vergeleken met die van de oorspronkelijke tumor 8. Daarentegen is het gebruik van gevestigde cellijnen relevante modelsystemen in kankeronderzoek controversieel. Reeds in 1987 Osborne en collega&#39;s beschreven significante biologische verschillen tussen MCF-7 menselijke borstkanker cellijnen van verschillende laboratoria 9. Deze uitgebreide genomische instabiliteit en variatie in RNA expressie in subcultuur werd gezamenlijknfirmed door Hiorns et al.. en voorzien van ondersteunende gegevens voor het bewijs dat cellijnen doen evolueren in de cultuur, hetgeen de directe relevantie van deze gevestigde culturen als modellen van kanker bij de mens 10. Een andere belangrijke overweging, die grotendeels genegeerd loop der jaren is het risico van besmetting of overmatige groei van culturen verbonden &quot;vals&quot; cellen, die eerst dan twintig jaar geleden benadrukt door aan te tonen dat een groot aantal cellijnen besmet waren met HeLa cellen 8,11. Verkeerde interpretatie van gegevens van &quot;false&quot; cellijnen is onlangs opnieuw licht in de literatuur. Een combinatie van DNA en moleculaire profilering cytogenetica, MacLeod et al.. Gebleken dat van 252 tumor afgeleide menselijke cellijnen gedeponeerd bij de Duitse verzameling van Micro-organismen en celkweken (DSMZ), bijna 18% bleken intraspecies of interspecies kruis 12,13-verontreinigingen. Om deze problemen te vermijden en om het gebruik van de bovengenoemde voordelen maken we besloten lage passage melanoomcellijnen stellen van gekloneerde metastasen. Robuuste cel scheiding en analyse technologieën vereisen single-cell voorbereidingen te genereren en tegelijkertijd het beperken van celdood en vernietiging van karakteristieke oppervlakte-eiwitten. Een benchtop instrument voor de geautomatiseerde dissociatie van weefsels in single-cell suspensies is de gentleMACS Dissociator vervaardigd door Miltenyi. In combinatie met gentleMACS C Tubes en geoptimaliseerde dissociatie oplossingen een effectieve en zachte dissociatie van tumorweefsel in een gesloten systeem wordt bereikt met behoud antigen epitopen en vermindering celverlies. Het instrument biedt geoptimaliseerde, vooraf ingestelde programma&#39;s voor een verscheidenheid aan specifieke toepassingen en garandeert gestandaardiseerde voorbereiding van single-cell suspensies van melanoom weefsel 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Recente rapporten blijkt dat de meeste tumoren een kleine subpopulatie van zogenaamde kankerstamcellen (CSC), die uitsluitend vertonen tumor-initiërende en zelfvernieuwende capaciteit herbergen. De identificatie van melanocyt-producerende stamcellen in de dermis van de huid geleid tot de hypothese dat deze cellen kan het ontstaan ​​van kanker stamcellen (CSC) in melanoom omdat blootstelling aan UVA-straling kunnen deze cellen primen voor maligne transformatie 15. Het resultaat van dergelijke genetische laesie zou cellen die een combinatie van tumor en stamcel kenmerken herbergen. Een van de belangrijkste markers voorgesteld de subpopulatie van CSCs vertegenwoordigen melanoom CD133 16-20. CD133 (ook bekend als Prominin 1), een lid van Pentaspan transmembraan glycoproteïnen, uitgedrukt in hematopoietische stamcellen, endotheliale progenitor cellen, neuronale en gliale stamcellen 21-23. Expressie van CD133 samenhangt metasymmetrische celdeling 24, en geglycosyleerde epitoop van CD133 werd aangetoond dat downgereguleerd op celdifferentiatie 25. Recent werden CD133 + melanomacellen getoond zelfvernieuwing en tumor-initiatie vermogen 19,20 hebben. Om de functie van CD133 + vermeende melanoom CSC te bestuderen, hebben we aangepast en geoptimaliseerd de Magnetic-geactiveerde celsortering (MACS) systeem van Miltenyi Biotech tot zeer verrijkt en levensvatbare populaties van CD133 + en CD133 te verkrijgen - cellen. Magnetische bead-based celscheiding stelt ieder negatieve selectie zoals getoond door Matheu et al. 26. Of positieve selectie als we hier weergegeven. In positieve selectie het specifieke doelcel, bijv. CD133 tot expressie brengende cellen, magnetisch gelabeld met microbolletjes, 50 nm superparamagnetische deeltjes die zijn geconjugeerd tot zeer specifieke antilichamen tegen eenspecifieke cel oppervlakte antigen. Tijdens scheiding worden de magnetisch gemerkte cellen vastgehouden in de kolom in het magnetische veld van de separator, terwijl ongelabelde cellen doorstromen. Na wasstappen werd de kolom uit het magnetische veld van de separator en de doelcellen van de kolom geëlueerd. De LS of MS kolommen tijdens positieve selectie resulteert in fracties van gelabelde en ongelabelde cellen met hoge zuiverheid. Anderzijds, LD kolommen gebruikt voor negatieve selectie, leiden tot een iets lagere zuiverheid van de gelabelde fractie. Door de dichtere pakking van de matrix het debiet in deze kolommen lager resulterende in een hoger risico gelabelde cellen te zitten in de kolom. LD kolommen moet daarom alleen worden gebruikt voor strenge uitputting van een ongewenste cel subpopulatie. Positieve selectie kan worden uitgevoerd door direct (antilichaam gekoppeld aan microbolletjes) of indirect magnetische labeling (incubatie met microbolletjes na incubation met het primaire antilichaam). Specifieke MACS microkorrels zijn beschikbaar voor de positieve selectie van verschillende celtypen van primaire tumorcellen zoals prostaat of melanoom 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericine B oplossing 250 ug / ml in gedeïoniseerd water </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblasten microkorrels </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS zonder Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout uitdrogen (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirecte CD133 Micro-Bead Kit menselijke </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Bevat CD133 / 1 (AC133)-biotine, anti-biotine microbeads en FcR Blocking Reagent </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine, vloeistof (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Blood Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr> &lt;td&gt; Mobiele zeef (70 micrometer) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Multi Stand </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Seperation Kolommen 25 LS Columns </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tube Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Separation Filters </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-spuit filters (0,22 pm, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filter Unit 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Ondanks verbeterde behandelingen opties voor melanoom die vandaag beschikbaar zijn, patiënten met gevorderd maligne melanoom hebben nog steeds een slechte prognose voor progressievrije en algehele overleving. Daarom translationeel onderzoek moet nadere moleculaire bewijs om gerichte therapieën voor maligne melanomen te verbeteren. In het verleden oncogene mechanismen gerelateerd aan melanoom uitgebreid bestudeerd in gevestigde cellijnen. Op weg naar meer persoonlijke behandelingen op basis van individuele genetische profielen, stellen we voor om patiënten afkomstige cellijnen in plaats van generieke cellijnen gebruiken. Samen met een hoge kwaliteit klinische gegevens, met name op de patiënt follow-up, zal deze cellen een grote rol spelen om beter inzicht in de moleculaire mechanismen achter melanoomprogressie. Hier beschrijven we de totstandkoming van primaire melanoom culturen uit ontleed vers tumorweefsel. Deze procedure omvat hakken en dissociatie van het weefsel in enkele cellen, reUitbouwen van verontreinigingen met erytrocyten en fibroblasten, evenals primaire cultuur en betrouwbare verificatie van de cellen &#39;melanoom oorsprong. Recente rapporten is gebleken dat melanomen, net als de meerderheid van de tumoren, haven een kleine subpopulatie van kanker stamcellen (CSC), die lijken om uitsluitend brandstof tumor initiatie en progressie in de richting van de metastatische staat. Een van de belangrijkste markers voor CSC identificatie en isolatie in melanoom is CD133. Om CD133 + CSCs isoleren van primaire culturen melanoom, hebben we aangepast en geoptimaliseerd magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) procedure van Miltenyi resulteert in een hoge zuiverheid en sortering levensvatbaarheid van CD133 + CSC en CD133 - bulk, die kunnen worden gekweekt en functioneel geanalyseerd daarna.

Bereiding van enkele cellen van tumorweefsel Figuur 2 illustreert een weggesneden lymfeklier van een laat stadium melanoom patiënt vóór (A) en na (B) mechanische dissociatie in 2-4 mm gesneden. Na enzymatische dissociatie van het weefsel en filtratie door een 70 urn nylongaas, cellen werden gepelletiseerd en de supernatant verwijderd. Bij deze stap neemt een sterke verontreiniging met erytrocyten zoals aangegeven door de rode kleur van de celpellet in figuur 2C.</str...

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende melanoom stamcellen worden gesorteerd van de CD133<sup&gt; -</sup&gt; Bulk met behulp van Magnetic geactiveerde cel sortering (MACS).

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Cultuur van de patiënt Tissue &amp; Onderzoek van Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Verrijking voor chemoresistent eierstokkanker stamcellen uit menselijke cellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...