Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
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Les auteurs remercient le Professeur M. Dietel et Dirk Schumacher pour soutenir ce travail et la lecture critique du manuscrit. Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du soutien de l&#39;entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 115234, les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les entreprises EFPIA »dans contribution en nature. Ce travail a également été soutenue par le Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

Le schéma global de l&#39;expérience, y compris la préparation des primaires simples cellules du tissu tumoral, la caractérisation de la culture cellulaire primaire, l&#39;épuisement des fibroblastes et le tri magnétique de cellules CD133 + et du CD133 - cellules de mélanome est illustré à la figure 1. 1. Acquisition d&#39;échantillon <ol><li> Vérifiez l&#39;approbation éthique avant d&#39;envisager les prochaines étapes. </li><li> Prépa...

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	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. 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M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

Afin d&#39;éliminer les contaminations érythrocytaires de la cellule tumorale pellets nous recommandons fortement d&#39;utiliser la solution de lyse des globules rouges à partir de Miltenyi. Les avantages de la lyse des érythrocytes au cours de la centrifugation sur gradient de Ficoll densité traditionnelle est qu&#39;il est plus rapide et plus simple. De plus, les contaminations par Ficoll ou de globules rouges et de la perte des cellules tumorales sont évités. Lorsque vous observez la croissance des fibroblaste...

Mélanomes malins cutanés sont le type le moins fréquent, encore plus mortelle de cancer de la peau. En raison d&#39;une incidence croissante, un haut grade de malignité et d&#39;une diffusion rapide, les mélanomes comptent maintenant pour 75% des tumeurs malignes de la peau liées 1,2 décès. En plus de l&#39;exérèse chirurgicale de la tumeur primitive, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie et combiné chimio-immunothérapie du mélanome et des métastases sont les stratégies state-of-the-art pour le traitement du mélanome 3,4. Toutefois, le mélanome malin est caractérisée par une faible réponse aux agents chimiothérapeutiques (5-12%) 5,6, et seulement ceux 50-70% de patients atteints de mélanome portant le gène BRAF V600E avantage mutation du gène de promettre de nouvelles thérapies ciblées que le traitement avec vemurafenib 7 Pour améliorer la survie globale, une meilleure compréhension des mécanismes de la tumorigenèse du mélanome est nécessaire. Pour étudier ces mécanismes dans le passé, bien établi commercialement des lignées cellulaires disponibles ont été utilisés. Des approches plus récentes pour étudier les événements moléculaires de l&#39;initiation et la progression du cancer utilisent des cultures primaires dérivées directement à partir de tissu tumoral - une stratégie avantages multiples paliers: Le chercheur a le plein contrôle du patient et de la sélection des tissus. Les cellules prélevées acquise dans le tissu tumoral sélectionnés par des experts, ressemblent à la tumeur avec tout son hétérogénéité et de suivi des données du patient et une pathologie détaillée est disponible pour permettre aux caractéristiques de la culture à comparer avec ceux de la tumeur d&#39;origine 8. En revanche, l&#39;utilisation de lignées cellulaires établies comme des systèmes modèles pertinents en recherche sur le cancer est l&#39;objet de controverses. Déjà en 1987, Osborne et ses collègues ont décrit des différences biologiques entre les MCF-7 lignes cellulaires cancéreuses mammaires de différents laboratoires 9. Cette instabilité génomique vaste et la variation de l&#39;expression des ARN au cours de la sous-culture a été confirmed par Hiorns et al. ont fourni des données et de soutien pour preuve que les lignées cellulaires ne évoluera dans la culture, ce qui affaiblit la pertinence directe de ces cultures établies comme des modèles du cancer humain 10. Une autre considération importante, qui a été largement ignoré au cours des années, est le risque de contamination ou de prolifération de cultures sans rapport avec «fausses» les cellules, ce qui a d&#39;abord été mis en évidence il ya vingt ans, en démontrant qu&#39;un grand nombre de lignées de cellules HeLa ont été contaminés par 8,11 cellules. La mauvaise interprétation des données de «faux» des lignées cellulaires a récemment mis au jour dans la littérature à nouveau. En utilisant une combinaison de profilage de l&#39;ADN et la cytogénétique moléculaire, MacLeod et al. Ont révélé que de 252 nouveaux dérivées de tumeurs des lignées cellulaires humaines déposé à la Collection allemande de microorganismes et de cultures cellulaires (DSMZ), près de 18% ont été jugés intraspécifique ou interspécifique croix -contaminants 12,13. Pour éviter ces problèmes et de faire usage des avantages mentionnés ci-dessus, nous avons décidé de mettre en place à faible passage des lignées de cellules de mélanome de métastases fraîchement excisées. Robustes cellulaires technologies de séparation et d&#39;analyse nécessitent unicellulaires préparations destinées à être produite tout en limitant la mort cellulaire et la destruction des protéines de surface caractéristiques. Un instrument de paillasse pour la dissociation automatisée des tissus dans une seule cellule suspensions est le Dissociator gentleMACS fabriqué par Miltenyi. Lorsqu&#39;il est utilisé en combinaison avec gentleMACS C Tubes et optimisé solutions dissociation, une dissociation efficace et doux de tissu tumoral dans un système fermé est obtenu tout en préservant épitopes d&#39;antigènes et de réduire la perte de cellules. L&#39;instrument offre optimisées, programmes pré-établis pour une variété d&#39;applications spécifiques et des garanties de préparation standardisée des suspensions unicellulaires à partir de 14 tissus mélanome. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De récents rapports ont révélé que la majorité des tumeurs abritent une petite sous-population de ce qu&#39;on appelle les cellules souches cancéreuses (CSC), qui présentent exclusivement des tumeurs initiation et la capacité d&#39;auto-renouvellement. L&#39;identification des cellules souches des mélanocytes qui produisent dans le derme de la peau conduit à l&#39;hypothèse que ces cellules pourraient être à l&#39;origine des cellules souches cancéreuses (CSC) dans le mélanome depuis l&#39;exposition aux UVA peut amorcer ces cellules pour la transformation maligne 15. Le résultat d&#39;une telle lésion génétique serait cellules qui abritent une combinaison de caractéristiques de la tumeur et les cellules souches. L&#39;un des marqueurs principaux proposés pour représenter la sous-population des CSC dans le mélanome est CD133 16-20. CD133 (également connu sous le nom prominine 1), un membre de glycoprotéines transmembranaires PENTASPAN, est exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques, les cellules progénitrices endothéliales, les cellules souches neuronales et gliales 21-23. L&#39;expression de CD133 est en corrélation avecla division cellulaire asymétrique 24, et l&#39;épitope glycosylé de CD133 a été montré pour être régulée à la baisse sur 25 différenciation cellulaire. Récemment, CD133 + cellules de mélanome ont été montré pour avoir l&#39;auto-renouvellement et la tumeur initiation capacité de 19,20. Pour étudier la fonction de CD133 + mélanome putatif CSC, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) système de Miltenyi Biotech pour obtenir des populations hautement enrichi et viable de CD133 et CD133 + - cellules. Séparation magnétique de cellules à base de billes permet soit la sélection négative comme le montre Matheu et al. 26 ou la sélection positive comme nous le montrons ici. Lors de la sélection du type positif cellule cible particulière, par exemple des cellules exprimant CD133, est marqué magnétiquement avec des microbilles, des particules superparamagnétiques 50-nm qui sont conjugués à des anticorps très spécifiques contre unparticulier antigène de surface cellulaire. Lors de la séparation, les cellules marquées magnétiquement sont retenus à l&#39;intérieur de la colonne dans le champ magnétique du séparateur, tandis que les cellules non marquées de les traverser. À la suite des étapes de lavage, la colonne est retirée du champ magnétique du séparateur, et les cellules cibles sont éluées de la colonne. Le LS ou colonnes MS utilisé pendant résultat de la sélection positive en fractions de cellules marquées et non marquées avec une grande pureté. D&#39;autre part, les colonnes LD, utilisés pour la sélection négative, conduisent à une pureté légèrement inférieure de la fraction marquée. En raison de la plus dense d&#39;emballage de leur matrice du débit dans ces colonnes est inférieur résultant en un risque plus élevé de cellules non marquées à être piégés dans la colonne. Colonnes LD devrait donc être utilisé que pour l&#39;épuisement sévère d&#39;une sous-population de cellules indésirables. Sélection positive peut être réalisée par marquage magnétique directe (anticorps couplé à des microbilles) ou indirecte (incubation avec des microbilles suivant la incubation avec l&#39;anticorps primaire). Spécifiques microbilles MACS sont disponibles pour la sélection positive de nombreux types cellulaires de cellules tumorales primaires comme la prostate ou de mélanome 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Laboratoires AAP GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B solution de 250 pg / ml dans de l&#39;eau désionisée </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblastes microbilles </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS sans Ca, Mg </td><td> Laboratoires AAP GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS supérieure </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirecte CD133 humain Kit Micro-Bead </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Comprend: CD133 / 1 (AC133)-biotine, anti-Biotine microbilles et le réactif de blocage FcR </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine, liquide (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> Laboratoires AAP GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red solution de lyse des globules (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell crépine (70 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociateur </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> Support multi séparateur MACS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes séparation MACS 25 colonnes LS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube MACSmix </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Avant sa cessation filtres </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Séparateur QuadroMACS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Filtres pour seringues Rotilabo (0,22 um, PSE) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP filtre Unité 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Malgré l&#39;existence de traitements améliorés pour les mélanomes disponibles aujourd&#39;hui, les patients atteints de mélanome malin avancé encore un mauvais pronostic pour la survie sans progression et globale. Par conséquent, la recherche translationnelle doit fournir une preuve supplémentaire moléculaire pour améliorer les thérapies ciblées pour les mélanomes malins. Dans le passé, les mécanismes oncogéniques liés au mélanome ont été largement étudiées dans des lignées cellulaires établies. Sur le chemin de traitements plus personnalisés basés sur les profils génétiques, nous proposons d&#39;utiliser des lignées cellulaires dérivées de patients au lieu de lignées cellulaires génériques. Avec les données cliniques de haute qualité, en particulier sur le suivi des patients, ces cellules seront déterminants afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l&#39;origine la progression du mélanome. Ici, nous présentons la mise en place des cultures de mélanomes primaires de tissu tumoral frais disséqués. Cette procédure comprend le hachage et la dissociation du tissu dans des cellules individuelles, reDépose des contaminations avec des érythrocytes et des fibroblastes ainsi que la culture primaire et de vérification fiable de l&#39;origine des cellules de mélanome. De récents rapports ont révélé que les mélanomes, comme la plupart des tumeurs, le port d&#39;une petite sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC), qui semblent exclusivement alimenter l&#39;initiation et la progression tumorale vers le stade métastatique. L&#39;un des principaux marqueurs pour l&#39;identification et l&#39;isolement du SCC dans le mélanome est CD133. Pour isoler CD133 + CSC à partir de cultures primaires de mélanome, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) procédure de Miltenyi résultant de la pureté de tri haute et la viabilité de CD133 + et CD133 CSC - en vrac, ce qui peut être cultivée et fonctionnellement analysé par la suite.

Préparation de mono-cellules provenant de tissu tumoral La figure 2 illustre une métastase ganglionnaire résection d&#39;un patient atteint de mélanome stade avancé avant (A) et après (B) dissociation mécanique en 2-4 morceaux mm. Après dissociation enzymatique du tissu et filtration à travers un maillage de 70 um nylon, cellules ont été sédimentées et le surnageant est rejeté. À cette étape, nous avons observé une forte contamination par les globules rouges, c...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches de mélanome sont triés du CD133<sup&gt; -</sup&gt; En vrac en utilisant magnétique tri cellulaire activé (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Culture ex vivo des tissus du patient et l&#39;examen de la livraison de gènes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Recherche

Médecine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...