Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
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Die Autoren danken Prof. M. Dietel und Dirk Schumacher für die Unterstützung dieser Arbeit und die kritische Durchsicht des Manuskripts. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Unterstützung der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking unter Finanzhilfevereinbarung n ° 115234, Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und EFPIA Unternehmen in zusammengesetzt sind erhalten Sacheinlage. Diese Arbeit wurde von der Berliner Krebsgesellschaft (BKG) unterstützt.

Das Gesamtkonzept des Versuchs einschließlich der Herstellung von primären Zellen aus Single-Tumorgewebe Charakterisierung des primären Zellkultur, Fibroblasten-Depletion und magnetische Zellsortierung von CD133 und CD133 + - Melanomzellen ist in Abbildung 1 gezeigt. Ein. Beispiel Acquisition <ol><li> Überprüfen ethischen Zulassung vor der Prüfung die nächsten Schritte. </li><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Tube mit sterilem PBS mit 1% Penicillin-Streptomycin...

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M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. 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Um Kontaminationen Erythrozyten aus dem Tumor Zellpellet entfernen empfehlen wir unter Verwendung des roten Blutkörperchens Lyselösung von Miltenyi. Die Vorteile Lysieren der Erythrozyten gegenüber dem traditionellen Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation sind, dass sie schneller und einfacher ist. Weiterhin werden Verunreinigungen mit Ficoll oder roten Blutkörperchen und dem Verlust von Tumorzellen vermieden. Wenn Sie das Wachstum von Fibroblasten in der primären Zellkultur beobachten sie sollten sofort entfernt we...

Kutane maligne Melanome sind die am wenigsten verbreitet, doch die meisten tödlichen Form von Hautkrebs. Aufgrund der steigenden Inzidenz, ein hoher Grad der Bösartigkeit und einer raschen Verbreitung, Melanome machen inzwischen 75% der malignen Hauttumoren Todesfälle 1,2. Neben chirurgischen Exzision des Primärtumors, Chemotherapie, Strahlentherapie, Immuntherapie und kombinierte Chemo-und Immuntherapie des metastasierten Melanoms sind die state-of-the-art Strategien für Melanom Behandlung 3,4. Allerdings ist das maligne Melanom durch eine schlechte Reaktion auf Chemotherapeutika (5-12%) 5,6, und nur diejenigen, 50-70% der Melanom-Patienten mit der BRAF V600E Genmutation profitieren von vielversprechenden neuen zielgerichteten Therapien wie die Behandlung mit vemurafenib 7 Um gekennzeichnet Verbesserung der allgemeinen Überlebensrate, wird ein viel besseres Verständnis der Mechanismen der Melanom Tumorgenese benötigt. Um diese Mechanismen in der Vergangenheit gut etablierte kommerzielle studierenallem zur Verfügung stehenden Zelllinien verwendet wurden. Neuere Ansätze, um die molekularen Ereignisse von Krebs Initiation und Progression zu studieren nutzen primären Kulturen direkt aus Tumorgewebe - eine Strategie Lager vielfältigen Vorteile: Der Forscher hat die volle Kontrolle des Patienten und Gewebe Auswahl. Die Zellproben gewonnenen fachmännisch ausgewählt Tumorgewebe, ähneln den Tumor mit all ihrer Heterogenität und Follow-up-Daten des Patienten und eine detaillierte Pathologie ist verfügbar, um die Charakteristiken der Kultur mit denen des ursprünglichen Tumors 8 verglichen werden. Im Gegensatz dazu ist die Verwendung von etablierten Zelllinien als relevant Modellsystemen in der Krebsforschung kontrovers diskutiert. Bereits 1987 Osborne und Kollegen beschrieben signifikante biologische Unterschiede zwischen humanen MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien aus verschiedenen Laboratorien 9. Diese umfassende genomische Instabilität und Variation in RNA Expression während der Subkultur war Confirmed durch Hiorns et al. und sofern unterstützenden Daten nach Beweisen, dass Zelllinien nicht in Kultur zu entwickeln und damit eine Schwächung der direkten Relevanz solcher etablierten Kulturen als Modelle von Krebs beim Menschen 10. Ein weiterer wichtiger Aspekt, der weitgehend über die Jahre ignoriert wurde, ist das Risiko einer Kontamination oder übermäßiges Wachstum von Kulturen mit fremden &#39;false&#39; Zellen, die erste hervorgehoben wurde vor über zwanzig Jahren durch den Nachweis, dass eine große Anzahl von Zelllinien durch HeLa kontaminiert waren Zellen 8,11. Die Fehlinterpretation von Daten aus &#39;false&#39; Zelllinien hat vor kurzem gekommen, um in der Literatur wieder anzuzünden. Mit einer Kombination von DNA-Profiling und molekularen Zytogenetik zeigte MacLeod et al., Dass von 252 neuen Tumor-abgeleiteten humanen Zelllinien hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), fast 18% wurden Intraspezies sein oder Interspezies Kreuz -Verunreinigungen 12,13. Um diese Probleme zu vermeiden und die Nutzung der oben genannten Vorteile zu machen, haben wir beschlossen, low-Passage Melanom-Zelllinien aus frisch herausgeschnitten Metastasen zu etablieren. Robust Zelle Trennung und Analyse Technologien erfordern Single-Cell-Präparate erzeugt gleichzeitig begrenzen Zelltod und die Zerstörung der charakteristischen Oberflächenproteine ​​werden. Ein Tischgerät für die automatisierte Dissoziation von Gewebe in den Single-Zellsuspensionen ist die gentleMACS Dissoziator von Miltenyi hergestellt. Wenn in Kombination mit gentleMACS C Rohre und optimierte Dissoziation Lösungen, eine effektive und schonende Spaltung von Tumorgewebe in einem geschlossenen System verwendet wird erzielt unter Beibehaltung Antigenepitope und Reduzieren Zellverlust. Das Gerät bietet optimiert voreingestellten Programmen für eine Vielzahl spezifischer Anwendungen und garantiert standardisierte Herstellung von Einzelzell-Suspensionen, die aus Melanom Gewebe 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Jüngste Berichte ergab, dass die Mehrzahl der Tumoren eine kleine Subpopulation von sogenannten Krebsstammzellen (CSCs), die ausschließlich weisen Tumor-Initiierung und sich selbst erneuernde Fähigkeit beherbergen. Die Identifizierung von Melanozyten-produzierenden Stammzellen in der Dermis der Haut führte zu der Hypothese, dass diese Zellen könnte die Entstehung von Krebs-Stammzellen (CSCs) in Melanomen, da UVA-Bestrahlung können diese Zellen für maligne Transformation 15 grundieren. Das Ergebnis eines solchen genetischen Läsion würden Zellen, die eine Kombination von Tumor und Stammzelleigenschaften beherbergen sein. Einer der wichtigsten Marker vorgeschlagen, die Subpopulation von CSCs in Melanomen darstellen, ist CD133 16-20. CD133 (auch als Prominin 1 bekannt), ein Mitglied der pentaspan transmembranen Glykoproteinen, wird in hämatopoetischen Stammzellen, Endothelprogenitorzellen, neuronale und gliale Stammzellen 21-23 exprimiert. Expression von CD133 mit korreliertenasymmetrischen Zellteilung 24 und das glykosylierte Epitop von CD133 konnte gezeigt werden herunterreguliert auf Zelldifferenzierung 25. Kürzlich wurden CD133 + Melanomzellen gezeigt, Selbsterneuerung und Tumor-Initiation Kapazität 19,20 zu haben. Um die Funktion von CD133 + putative Melanom CSCs zu studieren, haben wir modifiziert und optimiert die Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS)-System von Miltenyi Biotech, hoch angereichert und lebensfähige Populationen von CD133 + und CD133 zu erhalten - Zellen. Magnetkügelchen-basierten Zellabtrennung erlaubt entweder negative Selektion von Matheu et al. 26 oder positiver Selektion, wie wir hier zeigen. Während positiver Selektion die bestimmte Zielzelle Typ, zB CD133-exprimierenden Zellen, wird magnetisch mit MicroBeads, 50-nm-Partikel, superparamagnetische konjugiert hochspezifische Antikörper gegen ein markiert sindInsbesondere Zelloberflächenantigen. Während der Trennung werden die magnetisch markierten Zellen in der Säule in das Magnetfeld des Separators zurückgehalten, während unmarkierte Zellen durchfließen. Nach Waschschritten wird die Säule aus dem Magnetfeld des Separators entfernt wird, und die Zielzellen von der Säule eluiert. Die LS oder MS Spalten während positive Selektion Ergebnis in Bruchteilen von markierten und nicht markierten Zellen mit hoher Reinheit verwendet. Auf der anderen Seite, LD Spalten zur negativen Selektion verwendet wird, führen zu einer etwas geringeren Reinheit des markierten Fraktion. Aufgrund der dichteren Packung ihre Matrix die Strömungsgeschwindigkeit in diesen Spalten niedriger ist, was zu einem höheren Risiko von unmarkierten Zellen in der Säule eingefangen werden. LD Spalten sollten daher nur für strenge Depletion von einer unerwünschten Zell-Subpopulation verwendet werden. Positive Selektion kann durch direkte (Antikörper gekoppelt MicroBeads) oder indirekten magnetischen Kennzeichnung (Inkubation mit MicroBeads werden nach dem incubatio durchgeführtn mit den primären Antikörper). Spezifisch MACS MicroBeads sind für die positive Selektion von zahlreichen Zelltypen von primären Tumorzellen wie Prostata oder Melanom 27 verfügbar.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B-Lösung 250 ug / ml in entionisiertem Wasser </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fibroblasten Mikroperlen </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS ohne Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior- </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirekte CD133 Micro-Bead Kit menschlichen </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Inklusive: CD133 / 1 (AC133)-Biotin, anti-Biotin-Mikrokugeln und FcR Blockierungsreagenz </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin, flüssig (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Blood Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell Sieb (70 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS Dissoziator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Multi Stand </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Seperation Spalten 25 LS Columns </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tube Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567.440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Separation Filter </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-Spritzenfilter (0,22 um, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filter Unit 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Trotz verbesserter Behandlungen Optionen für Melanome heute verfügbar ist, Patienten mit fortgeschrittenen malignen Melanom noch eine schlechte Prognose für das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben. Daher muss der translationalen Forschung weiter molekulare Beweise für gezielte Therapien für maligne Melanome zu verbessern. In der Vergangenheit haben onkogenen Mechanismen im Zusammenhang mit Melanom wurden ausgiebig in etablierten Zelllinien untersucht. Auf dem Weg zur personalisierten Behandlungsschemata auf individuelle genetische Profile basieren, schlagen wir vor, Patienten-Zelllinien anstelle von generischen Zelllinien zu verwenden. Zusammen mit hochwertigen klinischen Daten, vor allem auf Patienten-Follow-up, werden diese Zellen maßgeblich zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die hinter Melanom Progression. Hier berichten wir über die Einrichtung von primären Melanomen Kulturen aus seziert frischem Tumorgewebe. Dieses Verfahren beinhaltet Zerkleinerns und Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen, refernung von Verunreinigungen mit Erythrozyten und Fibroblasten sowie primäre Kultur und zuverlässige Überprüfung der Zellen Melanom Herkunft. Jüngste Berichte zeigten, dass Melanome, wie die Mehrzahl der Tumoren, Hafen eine kleine Subpopulation von Krebsstammzellen (CSCs), die ausschließlich Kraftstoff Tumorinitiation und Progression in Richtung der metastatischen Stadium sein. Einer der wichtigsten Marker für CSC Identifizierung und Isolierung in Melanom ist CD133. Um CD133 + CSCs aus primären Melanom Kulturen zu isolieren, haben wir modifiziert und optimiert die Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) Verfahren von Miltenyi was zu hohen Sortenreinheit und Lebensfähigkeit der CD133 + CSCs und CD133 - bulk, die angebaut werden können und funktionell analysiert danach.

Herstellung von ein-Zellen aus Tumorgewebe Abbildung 2 zeigt beispielhaft ein resezierten Lymphknotenmetastasen von einem späten Stadium Melanom Patienten vor (A) und nach (B) mechanische Dissoziation in 2-4 mm große Stücke. Nach enzymatischer Spaltung des Gewebes und Filtration durch ein 70 um Nylonnetz wurden die Zellen pelletiert und der Überstand verworfen. Bei diesem Schritt beobachteten wir eine hohe Kontamination mit Erythrozyten als durch die rötliche Farbe des Zel...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativen Melanom Stammzellen werden aus der CD133 sortiert<sup&gt; -</sup&gt; Bulk mit Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

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Forschung

Medizin

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Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...