Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
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Gli autori ringraziano il Prof. M. Dietel e Dirk Schumacher per sostenere questo lavoro e criticamente la lettura del manoscritto. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno del innovativi in ​​materia di medicinali impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 115234, le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (FP7/2007-2013) e le imprese &#39;in dell&#39;EFPIA contributo di natura. Questo lavoro è stato supportato anche dal Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

La struttura generale della dell&#39;esperimento compresa la preparazione di singole cellule primarie da tessuto tumorale, la caratterizzazione della coltura di cellule primarie, deplezione fibroblasti e cell sorting magnetico di CD133 + e CD133 - cellule di melanoma è mostrato in Figura 1. 1. Esempio di acquisizione <ol><li> Verificare la presenza di approvazione etica prima di considerare i passi successivi. </li><li> Preparare un tubo da 50 ml con...

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	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. 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M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. 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Al fine di rimuovere contaminazioni eritrocitari dal pellet cellulare tumorale si consiglia di utilizzare la soluzione di globuli rossi del sangue lisi da Miltenyi. I vantaggi di lisare gli eritrociti rispetto alla tradizionale centrifugazione in gradiente di densità Ficoll sono che è più veloce e più semplice. Inoltre, contaminazioni con Ficoll o globuli rossi e la perdita di cellule tumorali sono evitati. Quando si osserva la crescita dei fibroblasti in coltura cellulare primaria devono essere rimossi immediatamen...

Cutanee melanomi maligni sono il tipo meno comune, ma più mortale di cancro della pelle. A causa di un aumento dei casi, un alto grado di malignità e di una rapida diffusione, melanomi ora rappresentano il 75% dei tumori maligni della pelle correlate 1,2 morti. Oltre l&#39;asportazione chirurgica del tumore primitivo, chemioterapia, radioterapia, immunoterapia e combinati chemio-immunoterapia del melanoma e metastasi sono state-of-the-art di strategie per il trattamento del melanoma 3,4. Tuttavia, il melanoma maligno è caratterizzato da una scarsa risposta a chemioterapici (5-12%), 5,6, e solo quelli il 50-70% dei pazienti affetti da melanoma che trasportano il gene BRAF V600E beneficio mutazione da promettenti nuove terapie mirate, come il trattamento con vemurafenib 7 Per migliorare la sopravvivenza complessiva, una migliore comprensione dei meccanismi di tumorigenesi melanoma è necessario. Per studiare questi meccanismi in passato, consolidata commerlinee cellulari cialmente disponibili sono stati utilizzati. Approcci più recenti per studiare gli eventi molecolari di iniziazione e la progressione del cancro utilizzare colture primarie derivate direttamente dal tessuto tumorale - un cuscinetto molteplici vantaggi strategici: Il ricercatore ha il pieno controllo del paziente e selezione dei tessuti. Le cellule campionate acquisita sapientemente selezionato tessuto tumorale, assomigliano il tumore con tutta la sua eterogeneità e follow-up dei dati del paziente e un dettagliato patologia è disponibile per consentire le caratteristiche della cultura per essere confrontati con quelli del tumore originale 8. Al contrario, l&#39;utilizzo di linee cellulari stabilizzate come sistemi modello nella ricerca sul cancro è discusso polemicamente. Già nel 1987 Osborne e colleghi hanno descritto significative differenze biologiche tra MCF-7 linee di cellule di cancro al seno umano da diversi laboratori 9. Questa instabilità genomica ampia variazione e l&#39;espressione di RNA durante sottocultura era confirmed da Hiorns et al. e ha fornito i dati di supporto per le prove del fatto che le linee di cellule si evolvono nella cultura, indebolendo in tal modo la rilevanza diretta delle culture così stabiliti come modelli di cancro umano 10. Un&#39;altra considerazione importante, che è stata largamente ignorata nel corso degli anni, è il rischio di contaminazione o di crescita eccessiva di culture con estranei &quot;falsi&quot; delle cellule, che è stato evidenziato più di venti anni fa, dimostrando che un gran numero di linee cellulari sono stati contaminati da HeLa cellule 8,11. L&#39;errata interpretazione dei dati di &quot;falsi&quot; linee cellulari è recentemente venuto alla luce nella letteratura di nuovo. Utilizzando una combinazione di DNA profiling e citogenetica molecolare, MacLeod et al. Rivelato che su 252 nuovi tumori derivati ​​da linee cellulari umane depositato presso la Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ), circa il 18% sono risultati intraspecie o interspecie croce -contaminanti 12,13. Per evitare questi problemi e di sfruttare i vantaggi di cui sopra, abbiamo deciso di stabilire basso passaggio da linee cellulari di melanoma metastasi asportati recentemente. Robuste cellule tecnologie di separazione e di analisi richiedono monocellulari preparati da generare contemporaneamente limitando la morte cellulare e la distruzione delle proteine ​​di superficie caratteristici. Uno strumento da banco per la dissociazione automatico di tessuti in sospensioni monocellulari è il dissociatore gentleMACS prodotto da Miltenyi. Quando usato in combinazione con gentleMACS C Tubi e ottimizzato soluzioni dissociazione, una dissociazione efficace e delicata del tessuto tumorale in un sistema chiuso viene raggiunto mantenendo epitopi antigenici e riducendo la perdita delle cellule. Lo strumento dispone ottimizzati, programmi preimpostati per una varietà di applicazioni specifiche e garanzie preparazione standardizzata di sospensioni monocellulari di melanoma tessuto 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studi recenti hanno rivelato che la maggior parte dei tumori porto una piccola sottopopolazione di cellule tumorali cosiddette staminali (CSC), che presentano esclusivamente tumore inizia e si auto-rinnovano capacità. L&#39;identificazione di melanociti che producono cellule staminali nel derma della pelle ha portato a formulare l&#39;ipotesi che queste cellule potrebbero essere l&#39;origine delle cellule staminali tumorali (CSC) nel melanoma, perché l&#39;esposizione alle radiazioni UVA possono innescare queste cellule per la trasformazione maligna 15. Il risultato di tale lesione genetica sarebbe cellule che ospitano una combinazione di tumore e le caratteristiche delle cellule staminali. Uno degli indicatori chiave proposti per rappresentare la sottopopolazione di CSC nel melanoma è CD133 16-20. CD133 (noto anche come Prominin 1), un membro di glicoproteine ​​transmembrana pentaspan, viene espressa in cellule staminali ematopoietiche, cellule progenitrici endoteliali, cellule staminali neuronali e gliali 21-23. Espressione di CD133 è correlata condivisione cellulare asimmetrica 24, e l&#39;epitopo glicosilata del CD133 è dimostrato downregulated sulla differenziazione cellulare 25. Recentemente, CD133 + cellule di melanoma hanno mostrato di avere auto-rinnovamento e tumore iniziazione capacità di 19,20. Per studiare la funzione di CD133 + putativo melanoma CSC, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) sistema da Miltenyi Biotech per ottenere popolazioni altamente arricchito e vitale di CD133 + e CD133 - cellule. Magnetica tallone basata separazione cellulare permette a ciascuna selezione negativa, come mostrato da Matheu et al. 26 o selezione positiva, come indicato,. Durante la selezione positiva il particolare tipo di cellula bersaglio, ad esempio, le cellule che esprimono CD133, è magneticamente etichettato con microsfere, 50-nm particelle superparamagnetiche che sono coniugati ad anticorpi altamente specifici nei confronti di unparticolare cellula antigene di superficie. Durante la separazione, le cellule marcate magneticamente sono trattenute all&#39;interno della colonna nel campo magnetico del separatore, mentre le cellule non marcate fluire attraverso. Seguendo fasi di lavaggio, la colonna viene rimosso dal campo magnetico del separatore, e le cellule bersaglio vengono eluite dalla colonna. Il LS o colonne MS utilizzata durante la selezione risultato positivo in frazioni di cellule marcate e non marcato con elevata purezza. D&#39;altra parte, colonne LD, utilizzati per la selezione negativa, risultato in una purezza leggermente inferiore della frazione etichettato. A causa della densa confezionamento di loro matrice portata in queste colonne è inferiore a un rischio più elevato di celle non etichettati da intrappolati nella colonna. Colonne LD deve pertanto essere utilizzato solo per l&#39;esaurimento rigorosa di una sottopopolazione cellulare indesiderata. Selezione positiva può essere eseguita direttamente (anticorpo accoppiato a microsfere) o indiretto marcatura magnetica (incubazione con microsfere seguito incubation con l&#39;anticorpo primario). MACS specifici microperline sono disponibili per la selezione positiva di numerosi tipi di cellule primarie di cellule tumorali come prostatico o melanoma 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericina B soluzione 250 mg / ml in acqua deionizzata </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblasti microsfere </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> , Ltd </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS senza Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Etilendiammintetraacetato sale disodico diidrato (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indiretta CD133 Micro-Bead Kit umano </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Include: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina microsfere e il reagente FcR blocco </td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina, liquido (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Blood Red Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell filtro (70 micron) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubi </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociatore </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Supporto Multi </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne di separazione MACS 25 colonne LS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tubo Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Filtri di separazione </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS separatore </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-siringa filtri (0.22 micron, PSE) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP filtro 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Nonostante il miglioramento delle opzioni di trattamento per il melanoma oggi disponibili, pazienti con melanoma maligno ancora hanno una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza libera da progressione e globale. Pertanto, la ricerca traslazionale ha bisogno di fornire altre prove per migliorare le terapie molecolari mirate per i melanomi maligni. In passato, i meccanismi oncogenici correlate a melanoma sono stati ampiamente studiati in linee cellulari stabilizzate. Sulla strada per regimi di trattamento più personalizzati basati su profili genetici individuali, si propone di utilizzare paziente linee cellulari derivate invece di linee cellulari generici. Insieme con i dati clinici di elevata qualità, in particolare sul follow-up, queste cellule sarà determinante per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della progressione del melanoma. Qui, si segnala l&#39;istituzione di colture primarie di melanoma sezionato tessuto tumorale fresco. Questa procedura include macinazione e la dissociazione del tessuto in cellule singole, rerimozione di contaminazioni con eritrociti e fibroblasti così come la cultura primaria e affidabile verifica di origine melanoma delle cellule. Recenti studi hanno rivelato che i melanomi, come la maggior parte dei tumori, porto una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che sembrano alimentare esclusivamente l&#39;iniziazione del tumore e la progressione verso lo stato metastatico. Uno degli indicatori chiave per l&#39;identificazione e l&#39;isolamento CSC nel melanoma è CD133. Per isolare CD133 + CSC da colture primarie di melanoma, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) procedura dal Miltenyi con conseguente elevata purezza smistamento e la vitalità delle CD133 + e CD133 CSC - massa, che può essere coltivato e funzionalmente analizzati successivamente.

Preparazione di singole cellule di tessuto tumorale La figura 2 esemplifica una metastasi linfa resecata nodo di un paziente prima fase tardiva melanoma (A) e dopo (B) meccanica dissociazione in 2-4 pezzi millimetri. Seguendo dissociazione enzimatica del tessuto e filtrazione attraverso una maglia di nylon 70 pm, cellule sono state pellettizzate e il supernatante scartato. In questa fase abbiamo osservato un&#39;elevata contaminazione con eritrociti come indicato dal colore ros...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putative cellule staminali di melanoma sono ordinati dal CD133<sup&gt; -</sup&gt; Massa utilizzando activated cell sorting magnetico (MACS).

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...