Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Forfatterne takker professor M. Dietel og Dirk Schumacher for å støtte dette arbeidet og kritisk lesing manuskriptet. Forskningen fører til disse resultatene har fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 115234, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskapenes i tingsinnskudd. Dette arbeidet ble også støttet av Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Den generelle ordningen av eksperimentet inkludert fremstillingen av primære single-celler fra svulstvev, karakterisering av primære cellekulturer fibroblast uttømming og magnetisk celle sortering av CD133 + og CD133 - melanomceller er vist i Figur 1. 1. Prøvetagning <ol><li> Sjekk for etisk godkjenning før man vurderer de neste trinnene. </li><li> Forbered en 50 ml tube med sterilt PBS supplert med 1% Penicillin-Streptomycin endelig konsentrasjo...

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

For å fjerne erytrocytt forurensing fra svulsten cellepelleten vi anbefale å bruke det røde blodlegemer lysis løsning fra Miltenyi. Fordelene med lysering erytrocyttene over den tradisjonelle Ficoll tetthetsgradient sentrifugering er at det er raskere og enklere. Videre er forurensninger med Ficoll eller røde blodceller og tap av tumorceller unngås. Når du observerer veksten av fibroblaster i den primære cellekulturer de bør fjernes umiddelbart siden de normalt overgrow kreftceller når venter for lenge. <p...

Kutane maligne melanomer er den minst vanlige, men mest dødelige typen hudkreft. På grunn av en økende forekomst, en høy grad av malignitet og en rask formidling, melanomer nå står for 75% av maligne hudsvulster dødsfall 1,2. Foruten kirurgisk excision av primærtumor, kjemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombinert kjemo-og immunterapi av metastasized melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling 3,4. Imidlertid er malignt melanom preget av en dårlig respons på kjemoterapeutika (5-12%) 5,6, og bare de 50-70% av melanom pasienter bærer BRAF V600E genmutasjon nytte lovende nye målrettede terapier som behandling med vemurafenib 7 Slik forbedre total overlevelse, er en mye bedre forståelse av mekanismene for melanom tumorigenesis nødvendig. Å studere disse mekanismene i det siste, veletablerte kommersiellesielt tilgjengelige cellelinjer ble brukt. Nyere tilnærminger til å studere molekylære hendelser av kreft initiering og progresjon utnytte primærkulturer avledet direkte fra svulstvev - en strategi bærende manifold fordeler: Forskeren har full kontroll over pasienten og vev utvalg. De undersøkte celler fått fra fagmessig valgt svulstvev, ligner svulsten med all heterogenitet sin og oppfølging for pasienten og en detaljert patologi er tilgjengelig for å tillate egenskapene til kultur å bli sammenlignet med dem av den opprinnelige svulsten 8. I kontrast, er bruken av etablerte cellelinjer som relevante modellsystemer i kreftforskning diskutert kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kollegene beskrevet betydelige biologiske forskjeller mellom MCF-7 menneskelige brystkreft cellelinjer fra ulike laboratorier 9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variasjon i RNA uttrykk under subkultur var confirmed av Hiorns et al. og ga støttende data for bevis for at cellelinjer gjør utvikles i kultur, og dermed svekke den direkte relevansen av slike etablerte kulturer som modeller av menneskelig kreft 10. En annen viktig faktor som i stor grad har blitt ignorert gjennom årene, er risikoen for forurensning eller overvekst av kulturer med urelaterte &quot;falske&quot; celler, som først ble markerte over tjue år siden ved å demonstrere at et stort antall av cellelinjer ble forurenset av HeLa celler 8,11. Feiltolkning av data fra &quot;falske&quot; cellelinjer har nylig kommet frem i lyset i litteraturen igjen. Ved hjelp av en kombinasjon av DNA-profilering og molekylære cytogenetikk avslørte MacLeod et al. At av 252 nye tumor-avledede humane cellelinjer deponert ved den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), nesten 18% ble funnet å være intraspecies eller interspecies kryss -forurensninger 12,13. For å unngå disse problemene og for å gjøre bruk av fordelene nevnt ovenfor, har vi besluttet å etablere lav passasje melanom cellelinjer fra ferske skåret metastaser. Robust cellen separasjon og analyse teknologier krever encellede forberedelser som skal genereres samtidig begrense celle død og ødeleggelse av karakteristiske overflateproteiner. En Borstemmaskin instrument for automatisert dissosiasjon av vev i encellede suspensjoner er gentleMACS Dissociator produsert av Miltenyi. Når den brukes i kombinasjon med gentleMACS C Rør og optimalisert dissosiasjon løsninger, en effektiv og skånsom dissosiasjon av svulstvev i et lukket system oppnås samtidig bevare antigen epitoper og redusere celletap. Instrumentet tilbyr optimalisert, forhåndsinnstilte programmer for en rekke spesifikke applikasjoner og garantier standardisert forberedelse av encellede suspensjoner fra melanom vev 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nye rapporter viste at flertallet av svulster havn en liten undergruppe av såkalte kreft stamceller (CSCS), som utelukkende utviser tumor-initiere og selv-fornyende kapasitet. Identifiseringen av melanocyte-produserende stamceller i dermis i huden ført til den hypotese at disse cellene kan være opprinnelsen til kreft stamceller (CSCS) i melanom siden eksponering for UVA-stråling kan prime disse cellene for malign transformasjon 15. Resultatet av en slik en genetisk lesjon ville være celler som er bærere av en kombinasjon av svulst og stamcelleegenskaper. En av de viktigste markørene kan sies å representere en undergruppe CSCS i melanom er CD133 16-20. CD133 (også kjent som Prominin 1), et medlem av pentaspan transmembrane glykoproteiner, er uttrykt i hematopoetiske stamceller, endotelceller progenitorceller, neuronal og glial stamceller 21-23. Uttrykk for CD133 er korrelert medasymmetrisk celledeling 24, og den glykosylerte epitop av CD133 ble vist å være downregulated upon celledifferensiering 25. Nylig ble CD133 + melanomceller vist seg å ha selvfornyelse og tumor-innvielse kapasitet 19,20. Å studere funksjonen til CD133 + antatte melanom CSCS, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech å få høyanriket og levedyktige bestander av CD133 + og CD133 - celler. Magnetisk perle-baserte celleseparasjon tillater enten negativ seleksjon som vist ved Matheu m.fl.. 26 eller positiv utvelgelse som vi viser her. Under positiv utvelgelse bestemt målcellen attraksjon, CD133 f.eks uttrykkende celler, er magnetisk merket med mikroperler, 50-nm superparamagnetiske partikler som er konjugert til høyst spesifikke antistoffer mot etbestemt celleoverflateantigen. Under separasjonen, er magnetisk merkede celler beholdes i kolonnen i det magnetiske feltet av separatoren, mens umerkede celler strømme gjennom. Etter vasketrinnene, er kolonnen fjernet fra magnetfelt av separatoren, og målcellene elueres fra kolonnen. LS eller MS kolonner brukes under positiv utvelgelse resultat i fraksjoner av merkede og umerkede celler med høy renhet. På den annen side, LD kolonner, som brukes for negativ seleksjon, resultere i en litt lavere renhet av den merkede fraksjonen. Grunnet tettere pakking av matrise deres strømningshastigheten i disse kolonnene er lavere resulterende i en høyere risiko for umerkede celler å være fanget i kolonnen. LD kolonner bør derfor bare brukes for strenge uttømming av en uønsket celle undergruppe. Positiv utvelgelse kan utføres ved direkte (antistoff koplet til mikroperler) eller indirekte magnetisk merking (inkubasjon med mikroperler etter incubation med det primære antistoff). Spesifikke MACS mikroperler er tilgjengelig for positiv utvelgelse av tallrike celletyper primære tumorceller som prostata-eller melanom 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericin B-løsning 250 ug / ml i avionisert vann </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblaster mikroperler </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Firma: </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS uten Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt dehydrate (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirekte CD133 Micro-Bead Kit menneske </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Inkluderer: CD133 / 1 (AC133)-Biotin, anti-Biotin mikroperler og FcR Blokkering Reagent </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin, væske (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Red Blood Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utstyr </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell sil (70 mikrometer) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubes </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Multi Stand </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS seperation kolonner 25 LS kolonner </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tube Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Separation Filters </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-sprøytefiltre (0,22 mikrometer, PES) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP Filter Unit 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Til tross for bedre behandlinger alternativer for melanom tilgjengelig i dag, pasienter med avansert malignt melanom har fortsatt en dårlig prognose for progresjonsfri og total overlevelse. Derfor må translasjonsforskning å gi ytterligere molekylære bevis for å forbedre målrettet terapi for maligne melanomer. I det siste, onkogene mekanismer knyttet til melanom ble grundig studert i etablerte cellelinjer. På vei til mer personlige behandlingsregimer basert på individuelle genetiske profiler, foreslår vi å bruke pasient-deriverte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høy kvalitet kliniske data, spesielt på oppfølging av pasientene, vil disse cellene være medvirkende til bedre å forstå de molekylære mekanismene bak melanom progresjon. Her rapporterer vi etablering av primære melanom kulturer fra dissekert fersk svulstvev. Denne fremgangsmåten inneholder male og dissosiasjon av vevet inn enkeltceller, reFjerning av forurensninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålitelig verifisering av cellenes melanom opprinnelse. Nylige rapporter viste at melanomer, som de fleste svulster, havn en liten undergruppe av kreft stamceller (CSCS), som synes å utelukkende drivstoff startfasen og progresjon mot metastatisk staten. En av de viktigste markører for CSC identifisering og isolering i melanom er CD133. Å isolere CD133 + CSCS fra primære melanom kulturer, har vi endret og optimalisert Magnetic-Activated Cell Sortering (MACS) prosedyren fra Miltenyi resulterer i høy sortering renhet og levedyktigheten til CD133 + CSCS og CD133 - bulk, som kan dyrkes og funksjonelt analysert etterpå.

Utarbeidelse av enkelt-celler fra svulstvev Figur 2 eksemplifiserer en reseksjon lymfeknute metastasering av et sent stadium melanom pasient før (A) og etter (B) mekanisk dissosiasjon i 2-4 mm biter. Etter enzymatisk dissosiasjon av vevet og filtrering gjennom en 70 um nylonmesh ble celler pelletert og supernatanten kastes. På dette trinnet ble det observert en høy forurensning med erytrocytter som indikert av det rødlige fargen på cellepellet i fig 2C. De...

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Denne artikkelen beskriver fremstilling av nystekte oppnådd melanom vevet inn primære cellekulturer, og hvordan å fjerne forurensninger av erytrocytter og fibroblaster fra kreftceller. Til slutt beskriver vi hvordan CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte melanom stamceller er sortert fra CD133<sup&gt; -</sup&gt; Bulk hjelp Magnetic Aktivert Cell Sortering (MACS).

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berikelse for kjemoresistent eggstokkreft stamceller fra humane cellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolasjon og immortalization av pasient-avledet cellelinjer fra muskelbiopsi for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kvantitativ Massespektrometrisk Profilering av kreft-celle proteom Derived From Flytende og solide tumorer

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...