Name: patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Författarna tackar professor M. Dietel och Dirk Schumacher för att stödja detta arbete och kritiskt läsa manuskriptet. Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit stöd från initiativet för innovativa läkemedel gemensamt företag enligt bidragsavtal nr 115234, resurser som består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) och EFPIA företag &quot;i natura. Detta arbete stöddes också av Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Den övergripande planen för försöket med angivande utarbetandet av primära singel-celler från tumörvävnad, karakterisering av primära cellkulturer, fibroblast utarmning och magnetiska cellsortering av CD133 + och CD133 - melanomceller visas i figur 1. 1. Prov Förvärv <ol><li> Kontrollera om etiskt godkännande innan man överväger nästa steg. </li><li> Förbered en 50 ml tub med steril PBS kompletterad med 1% penicillin-streptomycin slutl...

<ol>
	<li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sunlight+causes+melanoma.">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li><li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma.">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li><li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma.">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li><li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine.">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li><li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).</li><li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms:+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre.">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches &#196;rzteblatt. 100, (2003).</li><li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation.">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li><li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines:+friend+or+foe.">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li><li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories.">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li><li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture.">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li><li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+cells+in+culture.">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li><li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source.">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li><li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cancer+cell+lines:+fact+and+fantasy.">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue.">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermis-derived+stem+cells:+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma.">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer.">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li><li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133++cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment.">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li><li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential.">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li><li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer/testis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133++melanoma+cells.">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li><li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cell+selection+is+an+alternative+to+CD34++cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells.">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li><li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133(+)+cells.">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1.">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li><li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker,+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer.">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification.">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors.">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells.">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li></ol>

För att ta bort erytrocyter föroreningar från tumören cellpelleten rekommenderar vi använder röda blodkroppar lys från Miltenyi. Fördelarna med lysera erytrocyter över den traditionella Ficoll densitetsgradientcentrifugering är att det är snabbare och enklare. Vidare föroreningar med Ficoll eller röda blodkroppar och förlust av tumörceller undvikas. När du observerar tillväxten av fibroblaster i den primära cellkulturen de bör tas bort omedelbart eftersom de normalt växa över tumörcellerna när de ...

Kutana maligna melanom är den minst vanliga, men mest dödliga typen av hudcancer. På grund av en ökande förekomst, en hög grad av malignitet och en snabb spridning, melanom står nu för 75% av maligna hudtumörer dödsfall 1,2. Förutom kirurgisk excision av primärtumör, kemoterapi, strålbehandling, immunterapi och kombinerad kemo-och immunoterapi av metastaserad melanom är state-of-the-art strategier för melanom behandling 3,4. Dock malignt melanom kännetecknas av en dåligt svar på kemoterapeutika (5-12%) 5,6, och endast de 50-70% av melanompatienter bär BRAF V600E nytta genmutation från lovande nya målinriktade behandlingar som behandling med vemurafenib 7 till förbättra total överlevnad, är en mycket bättre förståelse för mekanismerna bakom melanom tumörbildning behövs. Att studera dessa mekanismer i det förflutna, väletablerade kommersiellaciellt tillgängliga cellinjer användes. Nyare metoder för att studera de molekylära händelser cancer initiering och progression använder primära kulturer härledda direkt från tumörvävnad - en strategi bär mångahanda förmåner: Forskaren har full kontroll över patient och vävnad urval. De samplade cellerna fått från sakkunnigt utvalda tumörvävnad, liknar tumören med alla dess heterogenitet och uppföljning data för patienten och en detaljerad patologi är tillgänglig för att egenskaperna hos kulturen att jämföras med de ursprungliga tumören 8. Däremot är användningen av etablerade cellinjer som relevanta modellsystem i cancerforskningen diskuteras kontroversiellt. Redan i 1987 Osborne och kollegor beskrivs signifikanta biologiska skillnader mellan MCF-7 humana bröstcancercellinjer från olika laboratorier 9. Denna omfattande genomisk instabilitet och variation i RNA uttryck under subkultur var confirmed av Hiorns et al., och som stödjande data för bevis för att cellinjer inte utvecklas i kulturen, och därigenom försvaga direkt relevans för sådana etablerade kulturer som modeller för cancer hos människor 10. En annan viktig faktor, som till stor del har ignorerats under åren, är risken för kontaminering eller överväxt av kulturer med obesläktade &quot;falska&quot; celler, som först markerade över 20 år sedan genom att visa att ett stort antal cellinjer förorenade av HeLa celler 8,11. Den feltolkning av data från &quot;falska&quot; cellinjer har nyligen framkommit i litteraturen igen. Med en kombination av DNA-profilering och molekylära cytogenetik, avslöjade MacLeod et al. Som 252 nya tumörhärledda humana cellinjer deponerade vid det tyska samlingen av mikroorganismer och cellkulturer (DSMZ), nästan 18% befanns vara inom arten eller mellan arter kors -föroreningar 12,13. För att undvika dessa problem och att använda sig av de fördelar som nämns ovan, beslutade vi att etablera låg passage melanomcellinjer från nyligen utskurna metastaser. Robusta cell separation och analys teknik kräver encelliga preparat som skall genereras samtidigt begränsar celldöd och förstörelse av karakteristiska ytproteiner. En bänk instrument för automatiserad dissociation av vävnader i encelliga suspensioner är gentleMACS dissociator tillverkas av Miltenyi. Vid användning i kombination med C-gentleMACS Rör och optimerad dissociation lösningar, en effektiv och skonsam dissociation av tumörvävnad i ett slutet system uppnås samtidigt antigenepitoper och minska cellförlust. Instrumentet erbjuder optimerad, förinställda program för olika specifika tillämpningar och garantier standardiserade beredning av encelliga suspensioner från melanom vävnad 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nya rapporter visade att majoriteten av tumörer hyser en liten subpopulation av så kallade cancer stamceller (CSCs), som enbart uppvisar tumör-initiera och självförnyande förmåga. Identifieringen av melanocyt-producerande stamceller i dermis av huden ledde till hypotesen att dessa celler kan vara ursprunget av cancer stamceller (CSCs) i melanom, eftersom exponering för UVA-strålning kan prima dessa celler för malign transformation 15. Resultatet av en sådan genetisk lesion skulle vara celler som hyser en kombination av tumör och stamceller egenskaper cell. En av de viktigaste markörerna föreslås att representera subpopulationen av CSCs i melanom är CD133 16-20. CD133 (även känd som Prominin 1), en medlem av Pentaspan transmembrana glykoproteiner, uttrycks i hematopoetiska stamceller, endoteliala progenitorceller, neuronala och glia stamceller 21-23. Uttryck av CD133 är korrelerad medasymmetrisk celldelning 24, och den glykosylerade epitopen av CD133 visades vara nedreglerade vid celldifferentiering 25. Nyligen har CD133 + melanomceller visat sig ha självförnyelse och tumör-initiering kapacitet 19,20. För att studera funktionen av CD133 + förmodad melanom CSCs har vi modifierat och optimerat Magnetic cellsortering (MACS) system från Miltenyi Biotech att få höganrikat och livskraftiga populationer av CD133 + och CD133 - celler. Magnetisk pärla-baserad cellseparation möjliggör antingen negativ selektion såsom visas av Matheu et al. 26 eller positiv selektion som vi visar här. Under positiv selektion den särskilda mål-celltyp, t.ex. CD133-uttryckande celler, är magnetiskt märkta med mikrokulor, 50-nm superparamagnetiska partiklar som är konjugerade till mycket specifika antikroppar mot ettsärskilt cellytantigen. Under separering är de magnetiskt märkta cellerna kvarhålles i kolonnen i det magnetiska fältet i separatorn, medan omärkta celler strömma genom. Efter tvättningssteg, är kolonnen avlägsnas från det magnetiska fältet i separatorn, och målcellerna elueras från kolonnen. LS eller MS kolonner används under positivt val resulterar i fraktioner av märkta och omärkta celler med hög renhet. Å andra sidan, LD kolonner, som används för negativ selektion, resulterar i en något lägre renhet av den märkta fraktionen. På grund av tätare packning av sin matris flödeshastigheten i dessa kolumner är lägre resulterande i en högre risk för omärkta celler som skall fångas i kolumnen. LD kolumner bör därför endast användas för strikt utarmning av en oönskad cell subpopulation. Positiv selektion kan utföras genom direkt (antikropp kopplad till mikrokulor) eller indirekt magnetisk märkning (inkubation med mikrokulor efter incubation med den primära antikroppen). Specifika MACS mikropärlor är tillgängliga för positiv selektion av många celltyper av primära tumörceller som prostata eller melanom 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericin B-lösning 250 pg / ml i avjoniserat vatten </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblaster mikropärlor </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenas IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Applichem GmbH </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS utan Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Etylendiamintetraättiksyra dinatriumsalt dehydrat (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indirekt CD133 Mikro-Bead Kit humant </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Innehåller: CD133 / 1 (AC133)-biotin, anti-biotin mikropärlor och FcR Blocking Reagent </td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin, vätska (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Röda blodkroppar Lyseringslösning (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell sil (70 um) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Rör </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Multi Stand </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> MACS seperation kolumner 25 LS kolumner </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tube Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567.440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Källsortering filter </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS Separator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-sprutfilter (0,22 um, PSE) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP filterenhet 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Trots förbättrade behandlingar alternativ för melanom som finns idag, patienter med avancerat malignt melanom har fortfarande en dålig prognos för progressionsfri och total överlevnad. Därför måste translationell forskning för att ge ytterligare molekylära bevis för att förbättra riktade terapier för maligna melanom. Under de senaste, onkogena mekanismer relaterade till melanom var omfattande studerats i etablerade cellinjer. På vägen till mer personliga behandlingsregimer baserade på individuella genetiska profiler, föreslår vi att använda patientnära härledda cellinjer i stället för generiska cellinjer. Tillsammans med högkvalitativa kliniska data, speciellt om patienten uppföljning kommer dessa celler att bidra för att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom melanom progression. Här rapporterar vi inrättandet av primära melanom kulturer från dissekerade färsk tumörvävnad. Detta förfarande innefattar hackning och dissociation av vävnad till enskilda celler, reborttagande av föroreningar med erytrocyter och fibroblaster samt primär kultur och tillförlitlig kontroll av cellernas melanom ursprung. Färska rapporter visar att melanom, liksom majoriteten av tumörer, hamn en liten subpopulation av cancer stamceller (CSCs), som verkar uteslutande bränsle tumör initiering och progression mot metastaserande staten. En av de viktigaste markörer för CSC identifiering och isolering i melanom är CD133. För att isolera CD133 + CSCs från primära melanom kulturer har vi modifierat och optimerat Magnetic cellsortering (MACS) proceduren från Miltenyi resulterar i hög sortering renhet och livskraft CD133 + CSCs och CD133 - bulk, som kan odlas och funktionellt analyseras därefter.

Beredning av single-celler från tumörvävnad Figur 2 exemplifierar en resekerade metastas lymfkörteln ett sent skede melanompatient före (A) och efter (B) mekanisk dissociation i 2-4 mm bitar. Efter enzymatisk dissociation av vävnad och filtrering genom en 70 | im nylonnät, var cellerna pelleterades och supernatanten kastades. Vid detta steg vi observerade en hög förorening med erytrocyter såsom anges av den rödaktiga färgen på cellpelleten i figur 2C.</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma at JoVE.com

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

I den här artikeln beskriver framställningen av nyligen erhållna melanom vävnad i primära cellkulturer, och hur du tar bort föroreningar av erytrocyter och fibroblaster från tumörcellerna. Slutligen beskriver vi hur CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade melanom stamceller sorteras från CD133<sup&gt; -</sup&gt; Bulk med Magnetic cellsortering (MACS).

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex vivo kultur Patient Tissue &amp; Undersökning av Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av kardiomyocetisk Kärnor från Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Anrikning för kemoterapiresistent Ovarian cancerstamceller från humana cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolering och Immortalisering av patientgenererade cellinjer från muskelbiopsi for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kvantitativ Masspektrometrisk Profilering av cancer-cell proteom Derived From Liquid och solida tumörer

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering och odling Expansion av Tumörspecifika endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...