Name: chromosome preparation from cultured cells
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00
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Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato reso possibile da un finanziamento della Fondazione Patrick F. Taylor.

1. Cromosoma raccolta di cellule aderenti <ol><li> Protocollo standard <ol><li> Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (80% di confluenza), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare. Si raccomanda un minimo di 2 x 10 6 cellule. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 45 min. Usando una pipetta sterile, trasferire file multime...

<ol>
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Abbiamo utilizzato il presente procedimento per il cromosoma isolamento da cellule di vari organismi, tra cui vari tipi di cellule ottenute da umano, macachi Rhesus, ratti e topi 11,20-22. Il protocollo standard è disponibile, ma alcuni passaggi chiave e variabili potrebbe essere necessario regolare per questi diversi tipi di cellule. Diversi passaggi specifici sono cruciali sia nella preparazione cromosomica e G-bande per garantire la migliore qualità dei risultati. Una delle variabili che possono influenz...

Analisi cromosomica è una tecnica tradizionale utilizzata in tutto il mondo per diagnosticare instabilità cromosomica e riarrangiamenti che portano a malattie genetiche e tumori maligni 1,2,8,9. Inoltre, una risoluzione maggiore per la diagnosi e la ricerca di anomalie genetiche e costituzionali cancro acquisita può essere realizzato con la combinazione delle procedure citogenetiche classiche e metodologie citogenetiche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH) , e cariotipo spettrale (SKY) 14,15. Più recentemente, queste tecniche sono state utilizzate per la valutazione di instabilità cromosomica associata ricerca sulle cellule staminali. Anomalie del cariotipo come aneuploidia di cellule in coltura a lungo termine embrionali (ES) e cellule staminali di diversi organismi sono stati riportati da diversi laboratori. Recenti evidenze sostiene che alcune linee cellulari sono intrinsecamente più inclini al cromosoma instabilità indipendentemente dalle condizioni di coltura. Per questo motivo, al momento di stabilire e / o il mantenimento di linee di cellule staminali umane Rhesus, mouse, o, analisi cromosomica è raccomandata come parte del processo di controllo di qualità. Molti rapporti descrivono il crescente interesse per l&#39;uso di routine e citogenetica molecolare per monitorare la stabilità cromosomica di cellule staminali e cellule maligne o vari organismi in coltura 10-13. Questi protocolli sono sempre più utilizzati dai laboratori non genetici per una rapida valutazione cromosomica delle loro cellule in coltura 13. Presentiamo nostre procedure di base per la preparazione cromosoma da vari tipi di cellule, che possono essere applicate per entrambi gli scopi e le cellule clinici e di ricerca derivati ​​da vari organismi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

Cromosoma (citogenetica) analisi è ampiamente utilizzato per il rilevamento di instabilità cromosomica. Quando seguito da G-banding e le tecniche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), questa analisi ha la potente capacità di analizzare le singole celle per le aberrazioni che coinvolgono gli utili o le perdite di porzioni del genoma e riarrangiamenti che coinvolgono uno o più cromosomi. Negli esseri umani, anomalie cromosomiche si verificano in circa 1 ogni 160 nati vivi 1,2, il 60-80% di tutti gli aborti spontanei 3,4, il 10% dei nati morti 2,5, il 13% degli individui con malattia cardiaca congenita 6, 3-6% dei casi di infertilità 2, e in molti pazienti con ritardo dello sviluppo e difetti di nascita 7. Analisi citogenetica di malignità è abitualmente utilizzato dai ricercatori e clinici, come osservazioni di anomalie cromosomiche clonali hanno dimostrato di avere sia un significato diagnostico e prognostico 8,9.60; isolamento Cromosoma è prezioso per la terapia genica e la ricerca sulle cellule staminali degli organismi inclusi primati non umani e roditori 10-13. I cromosomi possono essere isolate da cellule di tessuti vivi, compresi i linfociti del sangue, fibroblasti cutanei, amniociti, placenta, midollo osseo, e campioni tumorali. I cromosomi sono analizzati nella fase metafase della mitosi, quando sono più condensati e quindi più visibile. Il primo passo della tecnica di isolamento cromosoma comporta la rottura delle fibre del fuso mediante incubazione con Colcemid, per evitare che le cellule di procedere alla fase successiva anafase. Le cellule sono poi trattate con una soluzione ipotonica e conservati nel loro stato gonfio di fissativo di Carnoy. Le cellule vengono poi trascinati nella vetrini e possono quindi essere utilizzati per una varietà di procedure. G-banding comprende il trattamento tripsina seguita da colorazione con Giemsa per creare luce caratteristico e bande scure. Lo stesso procedure isolare cromosomi può essere utilizzato per la preparazione di cellule per procedure quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY) 14,15.

Spread metafase alta qualità sono essenziali per l&#39;analisi cromosomica. Un test riuscito produce cromosomi che sono ben diffuse e di adeguata morfologia cromosoma. Cromosomi Correttamente G-banda contengono la luce caratteristico e modelli di bande scure. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Figura 1. Una diffusione cromosomico suc...

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Chromosome Preparation From Cultured Cells

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Research

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Biology

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