Name: chromosome preparation from cultured cells
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Arbeidet er beskrevet i dette manuskriptet ble gjort mulig ved midler fra Patrick F. Taylor Foundation.

En. Kromosom Høsting av heftende celler <ol><li> Standard protokoll <ol><li> Grow celler i henhold til bestemte celledyrking forhold. Når cellene har nådd logaritmisk fase (80% konfluens), tilsett 10 ul / ml av Colcemid til cellekulturkolbe. Et minimum på 2 x 10 celler 6 er anbefalt. </li><li> Inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 45 min. Ved hjelp av en steril pipette, overføre media fra cellene til en 15 ml konisk tube. Sett til side. </li><li> Forsiktig vask...

<ol>
	<li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li><li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).</li><li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages.">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li><li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions.">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li><li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stillbirth+classification&#8212;Developing+an+international+consensus+for+research:+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop.">Stillbirth classification&#8212;Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li><li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+congenital+heart+defects:+Current+knowledge.">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li><li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Syndrome:+Trisomy+21..">Down Syndrome: Trisomy 21..</a> PubMed Health. , (2010).</li><li>Cin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li><li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics.">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li><li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation.">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li><li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells.">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li><li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q.">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li><li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells.">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li><li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis.">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li><li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+cytogenetics:+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology.">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis.">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li><li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).</li><li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders.">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).</li><li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7R&#945;+deficiency+in+p53(null)+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis.">IL-7R&#945; deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li><li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--&gt;qter+due+to+paternal+Y;+16+translocation.">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22--&gt;qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li><li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements.">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

Vi har benyttet dagens prosedyre for kromosom isolert fra celler av ulike organismer, inkludert ulike celletyper hentet fra menneske, rhesus-aper, rotter og mus 11,20-22. Standarden protokollen er gitt, men enkelte viktige skritt og variabler kan være nødvendig å justere for disse ulike typer celler. Flere konkrete tiltak er avgjørende både i kromosom forberedelse og G-banding for å sikre best mulig kvalitet på resultatene. En av de variable som kan påvirke analysen, er den Colcemid inkubasjonstid. Ut...

Kromosomanalyse er en konvensjonell teknikk benyttes over hele verden til å diagnostisere kromosom ustabilitet og rearrangements fører til genetiske lidelser og malignitet 1,2,8,9. I tillegg kan en høyere oppløsning for diagnose og forskning av konstitusjonelle og kreft-ervervet genetiske avvik oppnås med en kombinasjon av de klassiske cytogenetiske prosedyrer og molekylære cytogenetiske metoder som fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) , og spektral karyotyping (SKY) 14,15. I den senere tid har disse teknikker blitt benyttet for evaluering av kromosom ustabilitet forbundet med stamceller. Karyotypic abnormaliteter som aneuploidy av langsiktige dyrkede embryonale celler (ES) og voksne stamceller av ulike organismer har blitt rapportert av flere laboratorier. Nyere bevis støtter at noen cellelinjer er iboende mer tilbøyelig til kromosom instabiLity uavhengig av kultur forhold. Av denne grunn, ved å etablere og / eller opprettholde menneske, mus eller Rhesus stamcellelinjer, er kromosom analyse anbefalt som en del av kvalitetskontrollen. Mange rapporter beskriver den økende interesse for bruk av rutinemessige og molekylære cytogenetikk å overvåke det kromosomale stabiliteten av stamceller og maligne celler eller forskjellige organismer i kulturen 10-13. Disse protokollene er i økende grad blir brukt av nongenetic laboratorier for rask kromosom vurdering av sine dyrkede celler 13. Vi presenterer våre grunnleggende prosedyrer for kromosom forberedelse fra ulike celletyper, som kan brukes for både klinisk og forskningsformål og celler som stammer fra ulike organismer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

Kromosom (cytogenetisk) analyse er mye brukt for påvisning av kromosom ustabilitet. Ved etterfulgt av G-striper og molekylære teknikker som fluorescens in situ hybridisering (FISH), har denne analysen den kraftige evne til å analysere de enkelte celler for forstyrrelser som involverer gevinster eller tap av deler av genomet, og rearrangementer som omfatter en eller flere kromosomer. Hos mennesker, kromosomfeil forekommer hos ca 1 pr 160 levendefødte 1,2, 60-80% av alle spontanaborter 3,4, 10% av dødfødsler 2,5, 13% av personer med medfødt hjertesykdom 6, 3-6% av ufruktbarhet tilfeller to, og i mange pasienter med forsinket utvikling og fødselsskader 7. Cytogenetisk analyse av malignitet er rutinemessig brukt av forskere og klinikere, som observasjoner av klonale kromosomavvik har vist seg å ha både diagnostisk og prognostisk betydning 8,9.60; Kromosom isolasjon er uvurderlig for genterapi og stamcelleforskning organismer, inkludert ikke-menneskelige primater og gnagere 10-13. Kromosomer kan bli isolert fra celler av levende vev, inkludert blod-lymfocytter, hudfibroblaster, amniocytes, placenta, benmargen, og vevsprøver. Kromosomene er analysert ved meta stadium av mitose, når de er mest kondensert og derfor mer synlig. Det første trinn i kromosomet isolasjon teknikken innebærer oppbrytning av spindefibre ved inkubasjon med Colcemid, for å hindre at celler fra å gå frem til det etterfølgende anaphase stadium. Cellene blir deretter behandlet med en hypoton løsning og bevart i sin utvidete form med Carnoy sin fikseringsmiddel. Cellene blir deretter slippes på ved sidene, og kan deretter benyttes for en rekke prosedyrer. G-banding omfatter trypsin behandling etterfulgt av farging med Giemsa å skape karakteristisk lys og mørke striper. Den samme procedure å isolere kromosomer kan anvendes for fremstilling av celler for prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH) og spektral karyotyping (SKY) 14,15.

Høy kvalitet metafase spreads er avgjørende for kromosomanalyse. En vellykket analysen gir kromosomer som er godt spredt og av egnet kromosom morfologi. Riktig G-båndede kromosomer inneholder den karakteristiske lyse og mørke båndmønstrene. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Figur 1. Vellykket kromosomal spredning hvori kromosome...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosomer kan bli isolert fra levende celler slik som lymfocytter eller hudfibroblaster, og fra organismer inkludert mennesker eller mus. Disse kromosompreparater kan videre benyttes for rutinemessig G-banding og molekylære cytogenetiske prosedyrer som for eksempel fluorescens in situ hybridisering (FISH), komparativ genomisk hybridisering (CGH), og spektral karyotyping (SKY).

Kromosom Forberedelse Fra dyrkede celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Visualisering av endoplasmatiske retikulum underdomener i dyrkede celler

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massivt Parallelle Reporter Analyser i dyrkede pattedyrceller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

En Rask Air-tørr slippe Chromosome Forberedelse Metode Passer for FISH i Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Utarbeidelse av Meiotic kromosom seg fra musen Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Co-immunoprecipitation analysen bruke endogene kjernefysiske proteiner fra celler kultivert Hypoxic vilkår

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Fremstilling av fett stamceller fra mus epididymal fettvev

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...