Name: murine spinotrapezius model to assess the impact of arteriolar ligation on microvascular function and remodeling
Uploaded: 2013-03-03T15:00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling at JoVE.com

Nous reconnaissons Kevin Macleod pour l&#39;utilisation de sa musique créative commons licence dans la vidéo associée, y compris (par ordre d&#39;apparition) son «salon de l&#39;aéroport,&quot; pistes &quot;Fond d&#39;écran&quot; et &quot;Mélodrame soir.&quot; Nous tenons également à remercier Ndubisi Okeke et Frederick Torstrick pour leur aide dans la vidéo chirurgie.

1. RSS Spinotrapezius Artery Surgery ligature <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale. Dans une seringue de 0,5 ml, formuler: 0,06 ml à 100 mg / ml de kétamine 0,03 ml de 20,0 mg / ml de xylazine 0,01 ml de 0,4 mg / ml atropine 0,30 ml de solution saline à 0,9%. Dose: 0,01 * ml par gramme de poids corporel, ip </li></ol> * Dose variables sur souche de souris et de stock, afin d&#39;ajuster en conséquence la récupération de la souris est à une heure de l&#39;induction. <ol start="2"><li> Appliquer une pommade ophtalmique standard pour éviter le dessèchement cornéen. </li><li> Enlever les poils du dos aide d&#39;un coupe de rognage, suivie par une brève application de la crème dépilatoire. </li><li> Désinfecter le champ opératoire avec de la chlorhexidine ou la povidone-iode. Alternate povidone-iode avec de l&#39;éthanol trois fois, en terminant par la povidone-iode. </li><li> Transfert de la souris sur la surface de travail chirurgical préalablement préparé, avec coussin chauffant et champ stérileen place. </li><li> Créer une incision linéaire (3-5 mm) à travers la peau du dos d&#39;environ 5 mm caudalement à la proéminence osseuse de l&#39;omoplate avec des ciseaux et des pinces iris modèle standard (par exemple FST, 11271-30) par tenting le tissu et la coupe parallèle à la rachis. Le site de l&#39;incision cible peut être identifié par la visualisation transdermique du coussin dorsal graisse s&#39;il ya suffisamment de pigmentation de la peau, coupé à l&#39;extrémité caudale du coussinet adipeux. Développer l&#39;incision au besoin, et s&#39;étendent à travers les couches cutanées secondaires à l&#39;aide de ciseaux à ressort. <ol><li> Note anatomique - Le muscle est spinotrapezius dorsalement et s&#39;étend à partir de T4 à L3 le long de chaque côté de la colonne vertébrale. Le bord antérieur s&#39;étend latéralement à environ l&#39;omoplate. Le muscle se rétrécit dans la direction caudale de telle sorte que la frontière est la plus postérieure médiane du bord antérieur, et peut fixer au ras de la colonne vertébrale. Deux poches graisseuses sont également important de noter, pose directement dorsale et ventrale pour les spinotrapeziusmuscle vers la moitié du crâne. </li><li> L&#39;inflammation due à l&#39;incision a été démontré qu&#39;il n&#39;a aucun effet sur la réponse remodelage vasculaire, la chirurgie ligature imposture n&#39;a montré aucun changement dans le remodelage de la vascularisation spinotrapezius. Deux facteurs spatiaux contribuent à ce résultat. L&#39;incision première est éliminé par 5 mm dans la direction crânienne de la région d&#39;intérêt, où la réponse vasculaire dans le muscle est généralement examiné. En outre, le site d&#39;incision sur la peau du dos est séparé du site de ligature des vaisseaux par un patin ventral graisse qui se trouve au-dessus de la troisième crânienne du muscle spinotrapezius. </li></ol></li><li> Rincer l&#39;incision avec une solution de Ringer chauffée à empêcher le dessèchement des muscles. Application de vasodilatateurs tels que la papavérine aidera à visualiser l&#39;artère cible pour la ligature. </li><li> Sous une loupe binoculaire, utiliser une pince à disséquer et émousser séparer (mais pas supprimer) la dorsale blanche coussinet adipeux du musc sous-jacenteculier des tissus afin de visualiser la vascularisation qui entre et sort de la spinotrapezius sur son bord latéral. </li><li> Localiser l&#39;artère cible, qui, avec une ou deux paires de nervures, passe à travers la couche de graisse qui est ventral à la spinotrapezius sur son chemin dans le bord latéral du muscle. Cette artère alimente une partie substantielle de la moitié caudale du muscle, qui peut être confirmée par la réflexion et le remplacement du muscle à observer le trajet de l&#39;artère à l&#39;intérieur du muscle. L&#39;emplacement cible pour la ligature est le segment de l&#39;artère ventrale de quitter le pavé gras et en entrant le muscle, et il est tout à fait accessible dans cette région. La paire artère veineuse peut être nécessaire de légèrement séparée de la plaquette ventrale de graisse dans cette région. Notez que le spinotrapezius est alimenté par plusieurs artères des veines paires, y compris les navires que les transversales soit les coussinets dorsaux et ventraux de graisse. Prenez soin de ne pas perturber ces navires. <ol><li> Plusieurs indicateurs peuvent être utilisés pour distinguer l&#39;artèrede la veine. Une des meilleures méthodes consiste à obstruer la circulation sanguine en douceur à la microsonde et se déplacer en amont loin du muscle; débit ne reprendra pas dans l&#39;artère jusqu&#39;à ce que l&#39;obstruction est libéré. La couleur peut également être utilisé comme paroi des veines contiennent une gaine blanchâtre de tissu conjonctif qui manquent artères. En outre, on peut considérer que le diamètre avant l&#39;application de vasodilatateur que les veines sont généralement de plus grande taille. </li></ol></li><li> L&#39;artère est généralement à proximité de sa veine jumelé, utilisez dissection avec une microsonde et n ° 5 pinces pour isoler un segment d&#39;environ 5 mm, en passant la microsonde arrière de l&#39;artère, et en utilisant la pointe pour faire un plus grand écart entre le naturel fente entre l&#39;artère et la veine. C&#39;est la brèche par laquelle la suture sera enfilée. </li><li> En utilisant un seul fil de suture 10-0 fil et le lieu d&#39;un porte-aiguille de ligature autour de l&#39;artère d&#39;alimentation (diamètre ~ um 70) vers l&#39;extrémité proximale du segment découpé à l&#39;aide d&#39;un noeud de chirurgien. PlaCE une ligature supplémentaire vers l&#39;extrémité distale du segment de l&#39;artère disséquée, avec une séparation suffisante entre les ligatures pour permettre transection de l&#39;artère. <ol><li> La petite échelle associée à l&#39;artère d&#39;alimentation spinotrapezius conduit à des difficultés chirurgicales a augmenté, par rapport à la ligature d&#39;un grand navire comme l&#39;artère fémorale. Chirurgiens inexpérimentés en particulier auront des taux élevés d&#39;avulsion, hémorragie accidentelle, et d&#39;autres complications chirurgicales. Il est particulièrement préoccupant de la difficulté d&#39;identifier et de couper l&#39;artère incolore après l&#39;écoulement a été entravée juste avant la coupe. Pour ces raisons, plaçant 2 ligatures est recommandé pour ceux habitués à la procédure, le chirurgien dispose d&#39;un guide visuel pour localiser l&#39;endroit où l&#39;artère transect ainsi qu&#39;une confirmation de la coupe avec la séparation facilement observable des 2 ligatures. Cependant, un chirurgien plus expérimenté peut trouver une ligature seule suffisante, tant qu&#39;ils sont en mesure de bienidentifier et couper les artères aval de la ligature. Bien que cette technique réduit le risque d&#39;entailler involontairement un bateau à proximité de la suture ligature forte, elle n&#39;est pas sans inconvénients, notamment la difficulté accrue pour confirmer l&#39;artère a été sectionnée. </li></ol></li><li> Vérifier la ligature en observant une diminution de la circulation sanguine (colonne dégagée RBC) en aval du site de ligature (c&#39;est à dire vers le muscle). </li><li> L&#39;aide de ciseaux de dissection de l&#39;artère ligaturé transect, entre les deux ligatures. Si une seule ligature a été placée (11a), couper avec un soin extrême dans la direction aval. </li><li> Chargées de médicament plain-film (1 mm) peut être placé en aval (caudale) dans le cadre de la procédure expérimentale. </li><li> Repositionnez le fascia déplacées et les tissus adipeux de leur orientation d&#39;origine. </li><li> Fermer l&#39;incision cutanée en utilisant 8-0 sutures non résorbables. Ensuite, placez la souris dans une cage de récupération chauffée préparé sous observation et d&#39;administrer un appropriate analgésique tel que la bupivacaïne, de 0.02 à 0,05 ml infiltration locale de 0,25%. </li></ol> 2. Spinotrapezius microscopie intravitale, in situ <ol><li> Anesthésier la souris dans une chambre d&#39;induction avec 3-4% d&#39;isoflurane vaporisé dans 100% d&#39;oxygène à un débit de 3-4 L · min -1. <ol><li> L&#39;utilisation de l&#39;anesthésie par inhalation est préférable pour les mesures fonctionnelles parce qu&#39;il ya moins de dépression cardio-vasculaires que les anesthésiques injectables. Si une anesthésie par inhalation à ne pas disponibles, longue durée d&#39;action des anesthésiques injectables, comme le pentobarbital sodique est préférable d&#39;éviter les injections répétées une fois que l&#39;animal a été placé. </li></ol></li><li> Une fois anesthésié, l&#39;isoflurane offrir continuellement à travers un masque d&#39;anesthésie (cône de nez aka) à des concentrations de maintenance (généralement ~ 2%) et le débit de 0,5-1 L · min -1. <ol><li> Souris principalement ventiler à travers les voies nasales, il est donc nécessaire pour couvrir leur nez avec le diaphragme masque d&#39;anesthésie. </li></ol></li><li> Si nécessaire, enlever les poils du dos aide d&#39;un coupe de rognage et de la crème dépilatoire. </li><li> Transporter l&#39;animal à la garniture de la chaleur. <ol><li> Il est important de maintenir la souris dans un état euthermiques pour lutter contre le froid vasoconstriction induite, ce qui peut être accompli par des lampes, coussins chauffants circulation d&#39;eau, micro-ondes chauffe tampons, etc </li></ol></li><li> Insérez la sonde de température rectale et mis en thermo-contrôleur à 35 ° C. </li><li> Faire une incision cutanée à l&#39;extrémité caudale des spinotrapezius l&#39;aide de ciseaux et des pinces iris modèle standard. </li><li> Prolongez l&#39;incision crânienne à la couche de graisse, ce qui crée une incision en fer à cheval, et couvrir le lambeau de peau d&#39;une pellicule plastique pour éviter la dessiccation. </li><li> Blunt disséquer le tissu conjonctif sous-cutané avec des pinces et ciseaux à ressort afin de maximiser la visibilité. </li><li> Placer les électrodes de stimulation toge à proximitéther que possible, afin de minimiser la taille du champ de courant, et de les positionner à l&#39;extrémité caudale du muscle exposé juste à côté du rachis. </li><li> Effectuer une stimulation test pour confirmer le placement des électrodes en utilisant un système d&#39;acquisition de données électrode, électrode de stimulation isolateur, et le contrôleur d&#39;ordinateur, avec des ondes carrées d&#39;une durée 200 ps, ​​2 mA d&#39;amplitude, livré à 1 Hz. </li><li> Placer une pellicule plastique sur le muscle exposé à éviter la dessiccation. </li><li> Commencer à chronométrer une période de 30 minutes au cours de laquelle seront diamètre des vaisseaux s&#39;équilibrer. </li><li> Placez le microscope intravitale sur le muscle spinotrapezius pour voir l&#39;architecture vasculaire. <ol><li> Si vous utilisez un objectif à immersion, déposer une goutte de PBS entre l&#39;objectif et la pellicule de plastique. </li></ol></li><li> Commençant au-dessus de l&#39;artériole principal (le plus grand vaisseau visible), manipuler la scène dans le plan XY pour localiser le navire d&#39;intérêt. <ol><li> Visualisation petite arterioles avec la lumière réfléchie microscope nécessite un plus grand contraste que celui prévu par la colonne des globules rouges. Nous utilisons principalement un microscope courant secondaire imagerie à fond noir pour améliorer le contraste microvasculaire, mais le contraste peut également être améliorée avec un microscope à lumière réfléchie fluorescent après l&#39;injection intraveineuse d&#39;un poids moléculaire élevé dextran fluorescent. </li></ol></li><li> Après l&#39;équilibration de 30 min, capturer une image / vidéo de la cuve d&#39;intérêt. </li><li> Stimuler le muscle avec des ondes carrées de 200 microsecondes durée, 2 mA d&#39;amplitude, prononcé à 8 Hz, pendant 90 secondes, tel que décrit ci-dessus. </li><li> Capture d&#39;une autre image de stimulation / vidéo immédiatement après et continuer à capturer chaque minute jusqu&#39;à ce récipient est retourné au diamètre de repos, ~ 10 min. </li><li> Répétez les étapes 6-18 en utilisant le muscle controlatéral. </li><li> L&#39;analyse des données peut être effectuée en temps réel avec étriers vidéo ou hors ligne avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Euthanasier la souris suiviment IACUC protocole. </li></ol> 3. Récolte des tissus Spinotrapezius et fixation <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale, la formulation que dans l&#39;étape RSS ligature l&#39;artère Spinotrapezius 1. </li><li> Faire une incision plusieurs millimètres crâniens à la proéminence osseuse de l&#39;omoplate de la souris en utilisant des ciseaux et des pinces iris modèle standard. Élargir l&#39;incision caudale latéralement puis sur les deux côtés. </li><li> Relâchez la peau du torse dorsale doucement reflétant la peau et couper l&#39;aponévrose superficielle. </li><li> Utilisez dissection pour enlever le tissu adipeux dorsal aide d&#39;une pince standard, puis refléter le muscle et le tissu adipeux même disséquer ventrale. </li><li> Retirer fascia du muscle en utilisant des pinces et ciseaux à ressort. Cette étape peut être longue et difficile, mais il est important d&#39;améliorer la coloration par immunofluorescence et d&#39;imagerie. Garder le tissu hydraté peut faciliter le retrait de la façade. </li><li> Localiserle bord latéral du muscle, et utiliser dissection pour séparer le muscle spinotrapezius du coussinet adipeux qui se trouve ventrale de celui-ci. </li><li> Poursuivre la dissection dans un crâne de direction caudale. Notez que plusieurs vaisseaux sanguins entrent et sortent de cette surface ventrale du muscle, si la perfusion est nécessaire, elle doit être effectuée avant recoupant ces navires. Notez également que dans la moitié caudale du muscle, ses inserts latéraux frontières dans le muscle couché ventral à elle. Certains de coupe peut être nécessaire le long de cette frontière de définir complètement et de libérer le bord. </li><li> D&#39;accise du muscle spinotrapezius. Pour ce faire: <ol><li> Le bord libre latéral du muscle comme décrit ci-dessus. </li><li> Couper transversalement sur mesure les plus crânienne du muscle. </li><li> Coupez le long du bord interne (le long de la colonne vertébrale), dans le plan sagittal. </li></ol></li><li> Répétez les étapes 4-9 procédure sur le muscle controlatéral, puis l&#39;euthanasier mouse par une méthode approuvée IACUC. </li><li> Fixer les tissus sur des lames de verre recouvertes de gélatine par immersion dans du méthanol froid (4 ° C) ou dans un paraformaldéhyde 4% / solution d&#39;eau désionisée à température ambiante pendant 20 min. <ol><li> Alternativement, fixation par perfusion peut être utilisé. Avant l&#39;étape 2, effectuez une thoracotomie, faire une incision dans l&#39;oreillette droite, et le système vasculaire perfuse avec 5 ml de 1 x tampon Tris salin avec 0,1 mM de CaCl 2 et l&#39;héparine 2% par le ventricule gauche, puis 5 ml de 4 % de paraformaldéhyde pour la fixation récipient, et enfin 5 ml de 1 × solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 mM de CaCl 2 7. </li></ol></li><li> Immédiatement après fixation, laver spécimen quatre fois pendant 20 min chacun. Avec 0,01 M de tampon phosphate salin (PBS) avec de la saponine à 0,1% </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Le modèle murin ligature spinotrapezius présenté ici est un modèle animal réel des petites entreprises pour étudier les adaptations fonctionnelles et structurelles qui résultent d&#39;une occlusion artérielle. Ce modèle est complémentaire au modèle largement utilisé ischémie des membres postérieurs 4, en ce qu&#39;elle fournit une vue d&#39;ensemble du muscle intact réseaux microvasculaires à haute résolution spatiale. En outre, parce que ce muscle est situé juste sous la peau du dos, il est accessible à l&#39;imagerie par microscopie série intravitale, et à l&#39;administration de médicaments par l&#39;intermédiaire de surfusion locale ou implantation film mince 2. Ces caractéristiques en font un modèle animal attrayant petit pour étudier les effets de nouvelles cibles thérapeutiques sur le remodelage vasculaire et vasodilatation fonctionnelle après l&#39;occlusion artérielle. Notez que la prudence devrait être utilisée lorsque l&#39;on compare les données acquises dans le modèle de ligature spinotrapezius aux données acquises dans le modèle de ligature des membres postérieurs en raison de plusieurs touche differences. Tout d&#39;abord, les muscles sont spinotrapezius muscles stabilisateurs, et ils diffèrent des muscles de la jambe en termes de fonction et de la distribution du type de fibre. Notre groupe a déjà montré que la ligature des artérioles du muscle spinotrapezius crée une hypoxie ou moins négligeable dans les souches de réseaux bien développés artériolaires collatéraux, par rapport à l&#39;hypoxie observée dans la patte arrière après la ligature de l&#39;artère fémorale dans le modèle des membres postérieurs 1,8 - 10. Nous avons également montré que le modèle de ligature spinotrapezius produit une réponse différente dans le remodelage souris Balb / c par rapport à souris C57BL / 6, avec les réseaux de souris Balb / c remodelage par nantissement capillaire et le remodelage C57bl / 6 par l&#39;élargissement de connexions artériolaires existants 3. Il ya un parallèle intéressant entre ces observations et celles faites dans les modèles de ligature des pattes arrière, dans lequel souris Balb / c connaître une reprise perfusion prolongée après la ligature par rapport à souris C57BL / 6 9,11,12 &lt;/ Sup&gt;. Dans d&#39;autres modèles d&#39;ischémie tissulaire, 13 ans de la souris entre les sexes 14 et la présence de la maladie 15 également avoir une incidence réponses des tissus »à l&#39;occlusion des artérioles, même si nous n&#39;avons pas encore testé ces prédicteurs dans le modèle de ligature spinotrapezius. D&#39;autre part, la taille de l&#39;artère qui est ligaturé dans le modèle spinotrapezius est sensiblement inférieure à l&#39;artère fémorale, et par conséquent, la ligature affecte un plus petit volume de tissu qui est plus en aval, c&#39;est à dire à un niveau inférieur de l&#39;arbre circulatoire, dans le spinotrapezius par rapport à la patte arrière 3. Par conséquent, la différence anatomique à l&#39;emplacement de la ligation de ces deux modèles doivent être considérés lors de la comparaison des réponses physiologiques respectifs (remodelage vasculaire, par exemple) à cette intervention. Troisièmement, la minceur des spinotrapezius peut autoriser l&#39;oxygène d&#39;atteindre la partie unperfused du tissu des pays voisinstissu, par rapport à l&#39;ischémie et l&#39;hypoxie combinée dans le modèle des pattes arrière comme indiqué ci-dessus 3. Quatrièmement, la reprise de l&#39;écoulement à la partie aval des spinotrapezius de la ligature est plus rapide que dans la ligature des membres postérieurs. Le modèle de ligature spinotrapezius est un modèle unique chronique et ne doit pas être confondue avec d&#39;autres modèles de l&#39;occlusion artérielle transitoire ou modèles de lésion d&#39;ischémie-reperfusion. Nous considérons qu&#39;il est possible d&#39;adapter ce modèle pour tenir compte de ces types de conditions, mais cela est hors de la portée des travaux présentés. Enfin, nous mettons en garde contre directement liés observations précliniques dans ce modèle à des manifestations cliniques de la maladie ischémique chez l&#39;homme, en particulier lors de l&#39;utilisation jeune et en bonne santé chez la souris et en raison des limites inhérentes physiologiques comme la fréquence cardiaque plus élevée 5. Néanmoins, nous considérons que ce nouveau modèle comme un outil précieux pour découvrir les mécanismes de base de réponses tissulaires à la ligature et d&#39;identifier le potentielcibles rapeutic dans un cadre in vivo. En plus des notes chirurgicales prévues dans la procédure de ligature des artères d&#39;alimentation spinotrapezius (note anatomique (6a), en distinguant l&#39;artère de la veine (9a), et l&#39;utilisation d&#39;une ligature seule (11a)), quelques autres aspects de la prestation de procédure discussion. Tout d&#39;abord, l&#39;incision initiale faite sur la frontière du coussinet adipeux dorsal (ou plusieurs mm caudale à l&#39;omoplate, si la visualisation transdermique n&#39;est pas possible) est idéalement rendu aussi petit que le chirurgien est à l&#39;aise avec, et élargi au cours de la procédure si nécessaire. Cette pratique réduit la suture nécessaire pour fermer l&#39;incision, ce qui est pratique pour le chirurgien, réduit le temps de la procédure, et est également moins irritant pour l&#39;animal lors de la récupération. Alternativement, une incision cutanée peut être plus appropriée en fonction de préférences du chirurgien, car le muscle peut être plus facile à trouver avec un champ élargi. Dans ce cas, l&#39;incision peutbénéficier d&#39;une forme en fer à cheval avec une face interne ouverte pour permettre le pliage en direction du dos. Tandis que l&#39;incision de la peau et s&#39;étendant à travers les couches de la peau secondaire, si un navire de surface est endommagée et provoque une hémorragie, une légère pression avec de la gaze stérile et laisser le temps d&#39;hémostase. A noter également, il est important de traiter le tissu avec la force minimale requise, et autant que possible tenir avec une pince plus proche de la frontière latérale du muscle et hors de la zone prévue ischémique. Cette pratique permet d&#39;éviter une lésion par écrasement, ce qui peut conduire à des réponses supplémentaires tissus inflammatoires à médiation qui peuvent confondre la réponse remodelage vasculaire provoquée par la ligature artérielle. En conclusion, nous avons démontré que l&#39;utilisation du muscle murin spinotrapezius comme un modèle chirurgical pour examiner les réponses vasculaires et des tissus à la ligature des artérioles. Ce modèle est adapté pour l&#39;évaluation intravitale des modifications vasculaires (pourPar exemple, la vasodilatation fonctionnel), et pour l&#39;évaluation ex vivo de modifications vasculaires (par exemple, l&#39;imagerie par immunofluorescence et la quantification des réseaux vasculaires). Les deux études pré-cliniques et cliniques ont démontré que la réponse d&#39;un individu à l&#39;obstruction des artérioles (par exemple via la ligature chez les souris ou les plaques d&#39;athérosclérose chez l&#39;homme) dépend de leur âge la présence ou l&#39;absence de maladie (diabète sucré), le diamètre de l&#39;artère obstruée , le patrimoine génétique de l&#39;individu, et la demande métabolique du tissu 11-15. Les modèles murins, comme celui présenté ici, le chercheur profiter des différences spécifiques de la souche anatomiques et génétiques et des maladies spécifiques phénotypes, ce qui facilite enquête sur ces relations complexes.

Les modèles animaux d&#39;ischémie chronique sont des outils précieux pour étudier la physiopathologie des maladies ischémiques, telles que la maladie artérielle périphérique, la maladie de l&#39;artère coronaire et une maladie cérébrovasculaire. Chez les rongeurs, comme chez les humains, l&#39;occlusion artérielle conduit à une réorganisation structurelle du réseau vasculaire, y compris artériogenèse et l&#39;angiogenèse. Chez les patients sains et les plus jeunes, ce remodelage peut être suffisant pour sauver les tissus de l&#39;ischémie induite par une blessure, mais co-morbidités telles que le diabète peut compromettre gravement le remodelage et la récupération. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent les événements de remodelage vasculaire est essentielle pour le développement de thérapies qui stimulent ces processus endogènes de revascularisation. À l&#39;heure actuelle, la ligature l&#39;artère fémorale ou la résection de la patte arrière est la technique de référence pour l&#39;étude chronique induite par l&#39;ischémie remodelage vasculaire chez les petits animaux 4,5. Analyse du diamètre, de connectivité et de réactivitéles microvaisseaux qui composent le réseau en aval vasculaires de l&#39;artère fémorale ligaturé est difficile, cependant, en raison de l&#39;épaisseur des muscles. Nous avons développé un modèle de ligature artériolaire dans le muscle de souris spinotrapezius: ligature unilatérale de l&#39;artère d&#39;alimentation latéral de ce muscle stabilisateur dorsale 1. Les spinotrapezius relativement minces (60-200 um) se prête à une immunocoloration visage en pour l&#39;évaluation de la topologie du réseau entier avec une seule cellule de résolution, ce qui permet un examen détaillé des événements remodelage vasculaire à travers l&#39;ensemble du tissu. Le spinotrapezius est aussi superficielle et accessible, et donc ses navires sont facilement observables par microscopie intravitale, pour la caractérisation efficace de l&#39;impact de la rénovation et de la ligature sur la réactivité vasculaire artériolaire. Dans ce rapport, nous décrivons en détail et de démontrer le modèle de souris spinotrapezius ligature des artérioles. La fois in vivo et ex vivo moithodes d&#39;évaluation de la chirurgie sont décrits ci-dessous, y compris la mesure de la vasodilatation fonctionnelle, qui a été montré pour être altérée dans des conditions ischémiques 6, et de l&#39;imagerie par immunofluorescence des réseaux microvasculaires ensemble du muscle. Nous incluons également les résultats de deux études pilotes distincts pour démontrer l&#39;utilité du modèle. Tout d&#39;abord, nous avons utilisé le modèle de ligature artérielle pour induire une augmentation statistiquement significative de la tortuosité navire souris C57BL / 6 (figure 2B). Augmente au cours de tortuosité artériogenèse dans artérioles collatérales. En d&#39;autres souches de souris, qui sont plus vulnérables à l&#39;ischémie due à l&#39;absence des artérioles collatérales (par exemple Balb / c), artérialisation capillaire est observée 10. Artérialisation capillaire est détecté par une augmentation des diamètres et le développement de α-actine musculaire lisse réactivité. Deuxièmement, la stimulation électrique fonctionnelle du muscle conduit à une vasodilatation des artérioles terminales de la spinotrapezinous (figure 3B).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Ciseaux Iris </td><td> FST </td><td> 14090-09 </td><td> Type: Outil </td></tr><tr><td> Taille 7 pinces </td><td> FST </td><td> 11271-30 </td><td> Type: Outil </td></tr><tr><td> Taille 5 forceps </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td><td> Type: Outil </td></tr><tr><td> Ciseaux à ressort </td><td> Roboz </td><td> RS5671 </td><td> Type: Outil </td></tr><tr><td> Microsonde </td><td> FST </td><td> 10140-03 </td><td> Type: Outil Peut être substitué par sonde droite </td></tr><tr><td> Porte-aiguille </td><td> FST </td><td> 12500-12 </td><td> Type: Outil </td></tr><tr><td> Chambre d&#39;admission </td><td> JD Dist médicale. Co., Inc </td><td> IC-1086 </td><td>Type: Equipment </td></tr><tr><td> Gel contour des yeux </td><td> Dechra </td><td> NDC 17033-211-38 </td><td> Type: Réactif </td></tr><tr><td> Heat pad </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Sonde de température rectale </td><td> FST </td><td> 21060-01 </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Électrodes de stimulation </td><td> FHC </td><td> UEWSGCSE0N1M </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Artisan Polymer Clay </td><td> Polyform </td><td> N / A </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Système d&#39;acquisition de données PowerLab </td><td> ADInstruments </td><td> ML 845 </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Isolateur de stimulation </td><td> ADInstruments </td><td> FE 180 </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> LabChart </td><td> ADInstruments </td><td> ML S060 / 7 </td><td> Type: Software </td></tr&gt; <tr><td> Lumière réfléchie microscope à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> BFXM </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Haute MW dextran fluorescent </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100MG </td><td> Type: Réactif </td></tr><tr><td> Étriers vidéo </td><td> Colorado Vidéo </td><td> 308 </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> Analyse automatisée vasculaire (AVA) </td><td> Microvision médicale </td><td></td><td> Type: Software </td></tr><tr><td> Anti-αSMA fluorophore conjugué </td><td> Sigma </td><td> 1A4-Cy3 </td><td> Type: Réactif Clonale, 1:100 </td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> BFXM </td><td> Type: Equipment </td></tr><tr><td> De haut poids moléculaire du dextrane fluorescent </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100MG </td><td> Type: Réactif </td></tr></tbody></table>

murine spinotrapezius model to assess the impact of arteriolar ligation on microvascular function and remodeling

Le spinotrapezius murin est une mince muscle superficiel de soutien squelettique qui s&#39;étend de T3 à L4, et est facilement accessible par incision de la peau dorsale. Son anatomie unique rend les spinotrapezius utile pour l&#39;étude des lésions ischémiques et le remodelage microvasculaire ultérieure. Ici, nous démontrons un modèle ligature des artérioles dans le muscle de souris spinotrapezius qui a été développé par notre équipe de recherche et publié antérieurement 1-3. Pour certaines souches de souris vulnérables, tels que la souris Balb / c, cette ligature crée de manière fiable l&#39;ischémie du muscle squelettique et sert de plate-forme pour l&#39;étude des thérapies qui stimulent la revascularisation. Les méthodes d&#39;évaluation sont aussi démontré, y compris l&#39;utilisation de la microscopie confocale et intravitale. Le spinotrapezius est bien adapté aux études d&#39;imagerie telles en raison de son accessibilité (anatomie superficielle dorsale) et minceur relative (60-200 m). Le muscle spinotrapezius peut être monté en surface, ce qui faciliteimagerie des tout-musculaires réseaux microvasculaires sans coupes histologiques. Nous décrivons l&#39;utilisation de la microscopie intravitale d&#39;acquérir paramètres suivant une procédure vasodilatation fonctionnelle, plus précisément, l&#39;augmentation du diamètre arterilar à la suite de la contraction musculaire. Nous démontrons également les procédures de récolte et de fixer les tissus, un précurseur nécessaire d&#39;immunomarquage études et l&#39;utilisation de la microscopie confocale.

Une vue chirurgical de l&#39;artère principale alimentant le muscle spinotrapezius qui subit une ligature est illustré à la figure 1, avec des étiquettes indiquant les domaines d&#39;intérêt. Une image confocale exemple de la région de la récolte et immunocolorées muscle situé directement en aval de l&#39;artère ligaturé une semaine après la ligature est représenté sur la figure 2A. Artérioles collatérales élargie contenant des muscles lisses exprimant l&#39;alpha-actine des cellules musculaires lisses (rouge) afficher tortuosité caractéristique la suite de la ligature. Tortuosité récipient, rapporté par le rapport entre longueur de trajet et la distance récipient cordon (ie, la ligne s&#39;étendant sur ​​les mêmes points de trajectoire du navire), dans le muscle ligaturé (à droite) est améliorée par rapport au muscle controlatéral non ligaturée (Figure 2B, n = 8) . Figure 3 montre les résultats d&#39;une étude pilote dans laquelle la borne artériole vasodilatation fonctionnelle a été mesurée en utilisant la microscopie intravitale. Comme prévu, les artérioles di<html> ameter augmente considérablement lorsque la contraction musculaire induite par stimulation électrique. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1highres.jpg"/> Figure 1. Champ chirurgical de muscle spinotrapezius réfléchie et de l&#39;artère d&#39;alimentation. L&#39;artère d&#39;alimentation est ligaturée aux deux endroits indiqués par A0. Entre ces ligatures et après une obstruction de flux sanguin, l&#39;artère est sectionnée à l&#39;emplacement indiqué par A. Le segment ciblé des transitions artère du patin ventral gras, souligné par C, dans le muscle spinotrapezius, présenté par D, à l&#39;emplacement indiqué avec sens de la flèche B. débit est indiqué par flèche en pointillés E. ghres.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Image confocale d&#39;un réseau microvasculaire du muscle spinotrapezius pour l&#39;étude pilote de tortuosité. (A) récoltée et le muscle entier a été monté immunocolorées pour le muscle lisse alpha-actine et imagée par microscopie confocale. Le champ de vision montre la région du muscle situé directement en aval de l&#39;artériole une ligature ligaturé après semaine. Vaisseaux tortueux sont évidentes dans le muscle à la suite de la ligature (B) les résultats des études pilotes montrent significativement augmenté (p = 0,035; test t de 1 Étudiant à queue d&#39;). Tortuosité présenté par microvaisseaux dans le muscle ligaturé, telle que mesurée par la longueur de chemin navire Rapport de distance de cordon pour un procès de souris C57BL / 6 (n = 8) par rapport au témoin controlatéral. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3highres.jpg"/> Figure 3. Imagerie par microscopie intravitale de la vasodilatation des artérioles spinotrapezius fonctionnelle in vivo. (A) microphotographies représentatives des artérioles terminales spinotrapezius au repos (à gauche) et immédiatement après la cessation de 8 contraction musculaire Hz (à droite). (B) Terminal artériole diamètre au repos ( 8,5 ± 0,5 um, à gauche) et immédiatement après (11 ± 1 pm, moyenne) 90 sec de la contraction musculaire, ce qui a considérablement augmenté diamètre artériolaire (p = 0,032; 1-tailed test t apparié) en souris Balb / C (n = 6). Changement pour cent ont indiqué (à droite).

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Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

Nous démontrons un modèle de ligature artérielle roman dans le muscle spinotrapezius murin, y compris une procédure étape par étape et une description de l&#39;instrumentation nécessaire. Nous décrivons la chirurgie et la mesure des résultats pertinents relatifs au remodelage du réseau vasculaire et une vasodilatation fonctionnelle en utilisant la microscopie confocale et intravitale.

Modèle murin Spinotrapezius pour évaluer l&#39;impact de la ligature artériolaire sur la fonction microvasculaire et Rénovation

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