Name: the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

Arbejdet af forfattere FCO, DF, JN, DJH og GDS ovennævnte er finansieret af Chief Scientist Office, tilskud nummer: ETM37 og støttet af Cancer Research UK Forsøgscenter Cancer Medicin Centre. Arbejdet i AL er finansieret af Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for pleje og helbredelse af kræft og Medical Research Council. IO er understøttet af en Royal Society of Edinburgh skotske regering Fellowship samfinansieres af Marie Curie-aktiviteterne og det britiske Medical Research Council. Forfatterne vil gerne takke SCOTRRCC medansøgere og samarbejdspartnere for deres nyttige drøftelser om nogle af de diskuterede emner i dette papir.

1. Identifikation af morfologiske og molekylære Tumor Heterogenitet <ol><li> Tumorer fjernet fra -80 ° C fryser og holdt på tøris. </li><li> Opdele tumorer i sektioner på ca 1 cm3. Kortlægge den oprindelige position af hver tumor sektion i forhold til hinanden og etiket med et unikt navn. Opbevar prøver i individuelle kryoglas ved -80 ° C indtil den skal bruges. </li><li> Coat prøver i OLT og skåret i en kryostat ved -22 ° C. </li><li> Prøver farvedes med hæmatoxylin-og eosin kontrastfarvning m...

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

The RPPA metode præsenteres her repræsenterer en high throughput alternativ til den udbredte, men forholdsvis lille produktion western blot teknik proteinanalyse. Fremgangsmåden tillader hundreder af prøver at være semi-kvantitativt analyseret og sammenlignet samtidig giver mulighed for direkte sammenligning af vigtige proteiner over et bredt udvalg af cellelinjer og vævsprøver. Multipleksering med forskellige antistofarter yderligere øger effekten af ​​teknikken tillader flere antistoffer, som anvendes samt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> aprotinin </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> phosphatase inhibitor cocktail 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> phosphatase inhibitor cocktail 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> protease inhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey blokeringspuffer </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40.000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85.600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robot spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame »fire bay diasholder </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slide - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT Gede-anti-muse-IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68.020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW Gede-anti-kanin-IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32.211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

I øjeblikket er der ingen helbredende behandling for metastatisk clear cell renal cell cancer, den hyppigste variant af sygdommen. En vigtig faktor for denne behandling modstand menes at være den molekylære kompleksitet af sygdommen 1. Målrettet terapi såsom tyrosinkinasehæmmer (TKI)-sunitinib er blevet anvendt, men kun 40% af patienterne vil reagere, med et overvældende flertal af disse patienter fik tilbagefald inden for 1 år 2. Som sådan spørgsmålet om iboende og erhvervet resistens i nyrecellecancer patienter er yderst relevant 3. For at studere modstand mod TKIs, med det ultimative mål at udvikle effektive, personlige behandlinger, er sekventiel væv efter en bestemt periode med målrettet terapi er påkrævet, en tilgang, der havde været en succes i kronisk myeloid leukæmi 4. Men anvendelsen af ​​en sådan strategi i renalcellecarcinom kompliceres af det høje niveau af bOTH inter-og intratumoral heterogenitet, der er en funktion af renalcellecarcinom 5,6 samt andre faste tumorer 7. Intertumoral heterogenitet skyldes transkriptomisk og genetiske forskelle er veletableret selv hos patienter med lignende præsentation, stadium og kvalitet af tumor. Desuden er det klart, at der er stor morfologisk (intratumoral) heterogenitet i RCC, som kan repræsentere endnu større molekylær heterogenitet. Detaljeret kortlægning og kategorisering af RCC tumorer ved kombineret morfologisk analyse og Fuhrman grading tillader valg af repræsentative områder for proteom analyse. Protein baseret analyse af RCC 8 er attraktiv på grund af sin udbredte tilgængelighed i patologi laboratorier, men kan det i princippet være problematisk på grund af den begrænsede tilgængelighed af specifikke antistoffer 9. På grund af dot blot arten af ​​omvendt fase Protein Arrays (RPPA), antistofspecificitet skal be prævalideret, som sådan en streng kvalitetskontrol af de anvendte antistoffer er af afgørende betydning. På trods af denne begrænsning af dot blot-format tillader, assay miniaturisering, der giver mulighed for trykning af hundredvis af prøver på et enkelt nitrocellulose slide. Trykte objektglas kan derefter analyseres på lignende måde til Western-analyse med anvendelse af mål-specifikke primære antistoffer og fluorescensmærkede sekundære antistoffer, der giver mulighed for multipleksering. Differential proteinekspression i alle prøverne på et objektglas kan derefter analyseres samtidigt ved at sammenligne det relative niveau af fluorescens på en mere omkostningseffektiv og højt gennemløb måde.

Et eksempel på et scannet RPPA slide kan ses i figur 4 (i) med både 680 og 800 nm viste kanaler. Separering af billeder ved bølgelængde, figur 4 (ii) giver hver pude på RPPA slide skal analyseres og individuelle proteinekspression bestemt Figur 4 (iii). Som det kan ses i figur 4 (iii) ekspression af individuelle proteiner tværs prøverne er unik med gelsolin har et højt niveau af ekspression over objektglasset i forhold til cMYC som har en meget ...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA muliggør protein ekspression af hundreder af prøver, udskrives på nitrocellulose objektglas til at blive udspurgt samtidigt under anvendelse af fluorescensmærkede antistoffer. Denne teknik er blevet anvendt til at studere virkningen af ​​lægemiddelbehandling heterogenitet inden clear cell renal carcinoma.

Anvendelse af omvendt fase-protein Arrays (RPPA) at udforske Protein Expression Variation i de enkelte renalcellecarcinom Kræft

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenitet Kortlægning af protein udtryk i tumorer ved hjælp af kvantitative Immunofluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion og Påvisning af Reactive Oxygen Species (ROS) i kræft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkører i en dyremodel for at afsløre Neurale, hæmatologisk, og adfærdsmæssige korrelater til PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Oprensning og Aggregering af amyloidprecursorprotein intracellulært domæne

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Microarray-baserede identifikation af individuelle HERV Loci Expression: Ansøgning til biomarkør opdagelse i Prostata Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Tre-Dimensional Kultur Assay til Udforsk Cancer Cell invasiv og satellit tumordannelse

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Ved hjælp af In Vitro Live-celle Imaging for at udforske kemoterapeutika leveret af Lipid-baserede nanopartikler

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

En effektiv Sieving metode til at isolere intakt Glomeruli fra voksen rotte nyre

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Præcision implementering af minimal erythema dose (MED) test til vurdering af individuel variation i menneskelig inflammatorisk respons

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...