Name: the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

Het werk van auteurs FCO, DF, JN, DJH en GDS hierboven genoemde wordt gefinancierd door de Chief Scientist Office, subsidie-nummer: ETM37 en ondersteund door het Cancer Research UK Experimenteel Kankeronderzoek Geneeskunde Centrum. Het werk van AL wordt gefinancierd door de Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, de Melville Trust voor de verzorging en genezing van kanker en de Medical Research Council. IO wordt ondersteund door een Royal Society of Edinburgh Schotse regering Fellowship medegefinancierd door Marie Curie-acties en het Verenigd Koninkrijk Medical Research Council. De auteurs willen graag SCOTRRCC mede-aanvragers en medewerkers bedanken voor hun nuttige discussies op een aantal van de onderwerpen die in dit document.

1. Identificatie van morfologische en moleculaire Tumor Heterogeniteit <ol><li> Tumoren verwijderd van -80 ° C vriezer en op droog ijs bewaard. </li><li> Verdeel tumoren in secties van ongeveer 1 cm 3. Kaart de oorspronkelijke positie van elke tumor sectie ten opzichte van elkaar en label met een unieke naam. Store monsters in afzonderlijke cryovials bij -80 ° C tot aan gebruik. </li><li> Coat monsters in LGO en gesneden in een cryostaat bij -22 ° C. </li><li> Monsters gekleurd met hematoxyline en eosine...

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

De hier gepresenteerde methode RPPA is een high throughput alternatief voor de veel gebruikte maar relatief lage doorzet western blot techniek eiwitanalyse. De werkwijze maakt honderden monsters te semi-kwantitatief geanalyseerd en vergeleken gelijktijdig waardoor directe vergelijking van de belangrijkste eiwitten in een brede selectie van cellijnen en weefselmonsters. Multiplexing met verschillende antistofspecies verder vergroot het vermogen van de techniek die meerdere antilichamen gelijktijdig worden gebruikt. De hi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> aprotinine </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> fosfatase-inhibitor cocktail 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> fosfatase-inhibitor cocktail 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> protease inhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey Blokkeringsbuffer </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40.000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robot spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame &#39;vier bay diahouder </td><td> Whatman papier </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slide - 2-Pad </td><td> Whatman papier </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT geit anti-muis IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68.020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW geit anti-konijn IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32.211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

Op dit moment is er geen curatieve behandeling voor gemetastaseerd clear cell niercelcarcinoom, de meest voorkomende variant van de ziekte. Een belangrijke factor in deze behandeling weerstand gedacht dat de moleculaire complexiteit van de ziekte 1 zijn. Gerichte therapie zoals tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib zijn gebruikt, maar slechts 40% van de patiënten, reageren met de overgrote meerderheid van deze patiënten relapsing binnen 1 jaar 2. Als zodanig de vraag intrinsieke en verworven resistentie in niercelkanker patiënten is zeer relevant 3. Met het oog op resistentie tegen studeren TKI&#39;s, met als uiteindelijk doel het ontwikkelen van efficiënte en gepersonaliseerde behandelingen, wordt sequentiële weefsel na een bepaalde periode van gerichte therapie nodig, een aanpak die succesvol was gebleken bij chronische myeloïde leukemie 4. Echter, de toepassing van een dergelijke strategie niercelcarcinoom wordt bemoeilijkt door de hoge both inter-en intratumorale heterogeniteit, wat een kenmerk is van niercelcarcinoom 5,6 en andere vaste tumoren 7. Intertumoral heterogeniteit als gevolg van transcriptoom-en genetische verschillen is goed ingeburgerd, zelfs bij patiënten met een soortgelijke presentatie, stadium en de graad van de tumor. Bovendien is het duidelijk dat er grote morfologische (intratumorale) heterogeniteit in RCC, die waarschijnlijk nog grotere moleculaire heterogeniteit vertegenwoordigen. Gedetailleerd in kaart brengen en categoriseren van RCC tumoren door gecombineerde morfologische analyse en Fuhrman indeling maakt het mogelijk de selectie van representatieve gebieden voor proteomische analyse. Eiwit analyse van RCC 8 is aantrekkelijk vanwege de algemene beschikbaarheid in pathologische laboratoria, maar de toepassing ervan kan problematisch vanwege de beperkte beschikbaarheid van specifieke antilichamen 9. Als gevolg van de dot-blot aard van de omgekeerde fase eiwitseries (RPPA), antilichaam de specificiteit moeten be geprevalideerde en als zodanig strenge kwaliteitscontrole van de gebruikte antilichamen is van het grootste belang. Ondanks deze beperking de dot blot format, dat de mogelijkheid assay miniaturisatie, waardoor het drukken van honderden monsters op een nitrocellulose dia. Afgedrukte dia kan vervolgens worden geanalyseerd op soortgelijke wijze als Western-analyse met behulp van doelspecifieke primaire antilichamen en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, waardoor multiplexing. Differentiële eiwitexpressie in alle monsters op een dia kunnen dan tegelijkertijd worden geanalyseerd door het relatieve fluorescentie in een kosteneffectieve en high-throughput manier.

Een voorbeeld van een gescande RPPA dia te zien in Figuur 4 (i) met zowel 680 en 800 nm kanalen getoond. Het scheiden van de beelden door golflengte, Figuur 4 (ii) in staat stelt elke pad op de RPPA slide te analyseren en individuele eiwit expressie bepaald figuur 4 (iii). Zoals te zien in figuur 4 (iii) de expressie van individuele eiwitten in de monsters is uniek met gelsoline met een hoog expressieniveau in vergelijking met de dia cMYC die een veel l...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA kan de eiwitexpressie van honderden monsters gedrukt op nitrocellulose dia gelijktijdig worden uitgelezen met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Deze techniek is toegepast om het effect van medicamenteuze behandeling heterogeniteit studeren in clear cell niercarcinoom.

Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

Het gebruik van een Opknoping gewicht System voor geïsoleerde renale arterie occlusie

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Met behulp van In Vitro Live-cel Imaging om te verkennen chemotherapeutica geleverd door lipide gebaseerde nanodeeltjes

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Nauwkeurige implementatie van minimale erytheem dosis (MED) testen om individuele variatie in menselijke ontstekingsreactie te beoordelen

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...