Name: the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

Die Arbeit von Autoren FCO, DF, JN, DJH-und GDS erwähnt durch den Chief Scientist Office, Grantnummer finanziert wird: ETM37 und unterstützt von der Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Die Arbeit von AL wird von der Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, die Melville Vertrauen für die Pflege und Heilung von Krebs und dem Medical Research Council finanziert. IO wird durch ein Royal Society of Edinburgh Scottish Government Fellowship by Marie-Curie-Maßnahmen und der UK Medical Research Council kofinanziert unterstützt. Die Autoren möchten SCOTRRCC Mitantragsteller und Mitarbeitern für ihre nützlichen Diskussionen über einige der Themen in diesem Papier diskutiert danken.

Ein. Identifizierung von morphologischen und molekularen Tumorheterogenität <ol><li> Tumore von -80 ° C Gefrierschrank entfernt und auf Trockeneis aufbewahrt. </li><li> Dividieren Tumoren in Abschnitte von etwa 1 cm 3. Karte die ursprüngliche Position von jedem Tumor Abschnitts relativ zu einander und das Etikett mit einem eindeutigen Namen. Lagern Sie die Proben in den einzelnen Kryoröhrchen bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Coat Proben in Oktober und schneiden in einem Kryostaten bei -22 ° C...

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

Die RPPA hier vorgestellte Methode stellt einen hohen Durchsatz Alternative zu den weit verbreiteten, aber vergleichsweise geringen Durchsatz Western-Blot-Technik von Protein-Analyse. Das Verfahren erlaubt Hunderte von Proben werden semiquantitativ ausgewertet und gleichzeitig zur direkten Vergleich der wichtigsten Proteine ​​in einem breiten Auswahl von Zelllinien und Gewebeproben. Multiplexen mit unterschiedlichen Antikörperspezies weiter erhöht die Leistung der Technik so dass mehrere Antikörper gleichzeitig e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> Proteaseinhibitorcocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey Blocking Buffer </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II Roboter spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame &quot;vier bay Diahalter </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slide - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW Ziege anti-Kaninchen IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

Derzeit gibt es keine kurative Behandlung für metastasierten klarzelligen Nierenzellkarzinoms, der häufigsten Variante der Krankheit. Ein wichtiger Faktor in diesem Therapieresistenz wird gedacht, um die molekulare Komplexität der Erkrankung 1 sein. Gezielte Therapie wie die Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI)-Sunitinib genutzt wurden, aber nur 40% der Patienten reagieren, mit der überwältigenden Mehrheit dieser Patienten schubförmig innerhalb von 1 Jahr 2. Als solche ist die Frage der intrinsischen und erworbenen Resistenz in Nierenzellkrebskranken ist höchst relevant 3. Um den Widerstand gegen TKI zu studieren, mit dem Ziel der Entwicklung wirksamer, individuell abgestimmte Behandlungen wird sequentielle Gewebe nach einer bestimmten Zeit der gezielten Therapie erforderlich, ein Konzept, das sich bewährt bei chronischer myeloischer Leukämie 4 hatte. Doch die Anwendung einer solchen Strategie in Nierenzellkarzinom ist durch das hohe Niveau der b kompliziertoth inter-und intratumorale Heterogenität, die ein Merkmal des Nierenzellkarzinoms 5,6 sowie anderen soliden Tumoren 7 ist. Intertumoral Heterogenität aufgrund der Transkriptom-und genetische Unterschiede ist gut, auch bei Patienten mit ähnlichen Präsentation, Stadium und Grad des Tumors festgestellt. Darüber hinaus ist es klar, dass es große morphologische (intratumorale) Heterogenität in RCC, die wahrscheinlich noch größere molekulare Heterogenität repräsentieren. Detaillierte Kartierungen und Kategorisierung von RCC Tumoren durch kombinierte morphologische Analyse und Fuhrman Einstufung ermöglicht die Auswahl von repräsentativen Flächen für Proteomanalyse. Protein-basierte Analyse der RCC 8 ist attraktiv wegen seiner breiten Verfügbarkeit in Pathologie-Laboratorien, aber ihre Anwendung problematisch sein kann aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern 9. Aufgrund der Dot-Blot Art der Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), Antikörper-Spezifität muss be vorvalidierten, als solche strengen Qualitätskontrolle von Antikörpern verwendet wird, ist von größter Bedeutung. Trotz dieser Einschränkung der Dot-Blot-Format nicht zulässt Assay Miniaturisierung, so dass für den Druck von Hunderten von Proben auf einen einzelnen Nitrocellulose Folie. Bedruckte Folien können dann in einer ähnlichen Weise wie Western-Analyse werden unter Verwendung von Ziel-spezifischen primären Antikörper und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper analysiert, so dass für Multiplexing. Differential Proteinexpression in allen Proben auf einer Folie kann dann gleichzeitig durch Vergleichen der relativen Pegel der Fluoreszenz in einer kostengünstigeren und Weise mit hohem Durchsatz untersucht werden.

Ein Beispiel eines gescannten RPPA Schieber kann in 4 (i) sowohl mit 680 und 800 nm dargestellt Kanäle erkennen. Trennen der Bilder durch Wellenlänge, Abbildung 4 (ii) kann jedes Pad auf der RPPA Schieber zu analysierenden und individuelle Proteinexpression bestimmt Abbildung 4 (iii). Wie in 4 gesehen werden kann, (iii) die Expression von Proteinen in den Proben ist einzigartig mit Gelsolin mit einem hohen Grad der Expression auf den ...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA ermöglicht die Proteinexpression von Hunderten von Proben auf Nitrozellulose Folien gedruckt, um gleichzeitig abgefragt werden, mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Diese Technik angewendet worden ist, um die Wirkung der medikamentösen Behandlung Heterogenität innerhalb klarzelligen Nierenkarzinom studieren.

Der Einsatz von Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) an Protein Expression Variation innerhalb der einzelnen Renal Cell Cancers erkunden

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

Die Verwendung eines Hanging-weight-System für Isolated Nierenarterie Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Forschung

Medizin

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenität Mapping von Protein Expression in Tumoren mittels quantitativer Immunfluoreszenz

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Eine effiziente Methode der Absiebung, intakten Glomeruli von Erwachsenen Ratte Niere zu isolieren

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Präzisionsimplementierung von Minimal Erythema Dose (MED)-Tests zur Beurteilung individueller Variationen in der menschlichen Entzündlichen Reaktion

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...