Name: the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

Arbeidet med forfatterne FCO, DF, JN, DJH og GDS nevnt ovenfor er finansiert av Chief Scientist Office, prosjekt nummer: ETM37 og støttes av Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Arbeidet med AL er finansiert av Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for omsorg og helbredelse av kreft og Medical Research Council. IO er støttet av en Royal Society of Edinburgh skotske regjeringen Fellowship cofunded av Marie Curie Actions og Storbritannia Medical Research Council. Forfatterne ønsker å takke SCOTRRCC co-søkere og samarbeidspartnere for deres nyttige diskusjoner om noen av temaene i denne artikkelen.

1. Identifikasjon av morfologiske og molekylære Tumor heterogenitet <ol><li> Svulster fjernet fra -80 ° C fryser og holdt på tørris. </li><li> Dele svulster i seksjoner på ca 1 cm 3. Kartlegge utgangsposisjonen av hver tumor seksjon i forhold til hverandre og etikett med et unikt navn. Oppbevar prøvene i enkelte kryorør ved -80 ° C til den er klar til bruk. </li><li> Pels prøver i oktober og kutte i en kryostaten ved -22 ° C. </li><li> Prøvene farges ved hjelp Hematoxylin og Eosin kontrafarging m...

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

Den RPPA metoden presentert her representerer en høy gjennomstrømning alternativ til den mye brukte men relativt lav gjennomstrømming Western blot teknikk av protein analyse. Fremgangsmåten tillater hundrevis av prøver for å være semi-kvantitativt analysert og sammenlignet samtidig muliggjør direkte sammenligning av sentrale proteiner over et bredt utvalg av cellelinjer og vevsprøver. Multipleksing med forskjellige antistoff arter øker ytterligere effekten av teknikken slik at flere antistoffer som skal brukes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> aprotinin </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> fosfatase inhibitor cocktail 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> fosfatase inhibitor cocktail 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> proteasehemmere cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey Blokkering Buffer </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robot spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame &#39;fire bay lysbildeholder </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slide - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT Geit anti-mus IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

Foreløpig er det ingen kurativ behandling for metastatisk klarcellet nyrecellekreft, den vanligste varianten av sykdommen. En nøkkelfaktor i denne behandlingen resistens er antatt å være den molekylære kompleksitet sykdom 1. Målrettet terapi som tyrosinkinasehemmer (TKI)-sunitinib har blitt utnyttet, men bare 40% av pasientene vil reagere, med overveldende flertall av disse pasientene fikk tilbakefall innen ett år 2. Som sådan spørsmålet om egenverdi og ervervet resistens i nyre celle kreftpasienter er svært relevant 3. For å studere motstand mot TKIs, med det endelige mål om å utvikle effektive, personlige behandlinger, sekvensiell vev etter en bestemt periode målrettet terapi nødvendig, en tilnærming som hadde vist seg vellykket i kronisk myelogen leukemi 4. Men anvendelsen av en slik strategi i nyrecellekarsinom kompliseres av det høye nivået av bOTH inter-og intratumoral heterogenitet, som er et trekk av nyrecellekarsinom 5,6 samt andre solide tumorer 7. Intertumoral heterogenitet grunn transcriptomic og genetiske forskjeller er godt etablert, selv hos pasienter med lignende presentasjon, scene og grad av tumor. I tillegg er det klart at det er stor morfologiske (intratumoral) heterogenitet i RCC, som er sannsynlig å representere enda større molekylær heterogenitet. Detaljert kartlegging og kategorisering av RCC svulster ved kombinert morfologisk analyse og Fuhrman gradering tillater valg av representative områder for proteomikk analyser. Protein analyse av RCC 8 er attraktiv på grunn av sin utbredte tilgjengeligheten i patologi laboratorier, men kan sin søknad være problematisk på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer 9. På grunn av dot blot natur omvendt fase Protein Arrays (RPPA), antistoffspesifisitet må be pre-validert, slik streng kvalitetskontroll av antistoffer som brukes er av overordnet betydning. Til tross for denne begrensningen dot blot format tillater analysen miniatyrisering, noe som åpner for utskrift av hundrevis av prøver på et enkelt nitrocellulose lysbilde. Trykte lysbilder kan deretter bli analysert på en lignende måte til Western analyse med bruk av target spesifikke primære antistoffer og fluorescensmerkede sekundære antistoffer, slik at for multipleksing. Differensiell proteinekspresjon tvers av alle prøvene på et lysbilde kan da bli analysert samtidig ved å sammenligne den relative nivået av fluorescens på en mer kostnadseffektiv og high-throughput måte.

Et eksempel på en skannet RPPA lysbilde kan sees i Figur 4 (i) med både 680 og 800 nm kanaler vist. Skille bildene ved bølgelengde, figur 4 (ii) gjør at hver blokk på RPPA lysbildet som skal analyseres og individuell protein ekspresjon bestemmes Figur 4 (iii). Som kan sees i figur 4 (iii) ekspresjon av individuelle proteiner tvers prøvene er unikt med Gelsolin har et høyt nivå av ekspresjon over lysbildet sammenlignet cMYC som har en mye lavere ...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA muliggjør protein uttrykk for hundrevis av prøver, trykt på nitrocellulose lysbilder å bli avhørt samtidig, ved hjelp av fluorescensmerkede antistoffer. Denne teknikken har blitt anvendt for å studere effekten av medikamentbehandling heterogenitet innenfor klarcellet nyrekarsinom.

Bruk av omvendt fase Protein Arrays (RPPA) til Explore Protein Expression Variasjon innen Individuelle nyre celle kreft

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenitet Kartlegging av Protein Expression i Svulster med Kvantitative immunfluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produksjon og Påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i Kreft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkører i en dyremodell for Avslører Neural, Hematologic, og Behavioral korrelerer av PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Rensing og aggregeringen av amyloid forløperprotein intracellulære domenet

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Microarray-baserte Identifikasjon av Individuell Herv Loci Expression: Søknad til biomarkører i Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Tredimensjonal Kultur analysen til Explore Cancer Cell Invasivitet og satellitt tumordannelse

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Bruke In Vitro Live-celle Imaging for å utforske Chemotherapeutics levert av Lipid-baserte nanopartikler

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Effektiv Sieving metode å isolere intakt Glomeruli fra voksen rotte nyre

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision implementering av minimal erythema dose (MED) testing for å vurdere individuell variasjon i Human inflammatorisk respons

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...