Name: the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00
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El trabajo de los autores FCO, DF, JN, DJH y GDS se ha mencionado anteriormente es financiado por la Oficina de Director Científico, el número de concesión: ETM37 y apoyado por el Centro de Cáncer Research UK Medicina Experimental del Cáncer. La obra de AL es financiado por el Colegio Real de Cirujanos de Edimburgo Robertson Trust, el Fideicomiso de Melville para el cuidado y la cura del cáncer y el Consejo de Investigación Médica. IO es apoyado por una beca de la Royal Society de Edimburgo Gobierno escocés cofinanciado por las acciones Marie Curie y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido. Los autores desean agradecer a SCOTRRCC cosolicitantes y colaboradores por sus útiles debates sobre algunos de los temas tratados en este documento.

1. La identificación de la heterogeneidad morfológica y molecular del tumor <ol><li> Tumores extraídos de -80 ° C congelador y se mantuvo en hielo seco. </li><li> Dividir los tumores en secciones de aproximadamente 1 cm 3. Mapear la posición original de cada sección del tumor respecto a la otra y la etiqueta con un nombre único. Almacenar las muestras en crioviales individuales a -80 º C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Muestras de abrigo en octubre y cortadas en un criostato a -22 ° C....

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

El método que aquí se presenta RPPA representa una alternativa de alto rendimiento para la técnica de transferencia rendimiento ampliamente utilizado, pero relativamente baja occidental de análisis de proteínas. El método permite a cientos de muestras a ser semi-cuantitativamente analizados y comparados simultáneamente permitiendo la comparación directa de las proteínas clave a través de una amplia selección de líneas celulares y muestras de tejidos. Multiplexación con especies diferentes de anticuerpo aume...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> aprotinina </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> cóctel de inhibidores de fosfatasa 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> cóctel de inhibidores de fosfatasa 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> cóctel inhibidor de la proteasa </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey tampón de bloqueo </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robot vigilante </td><td> Biorrobótica </td><td></td></tr><tr><td> Cuatro FastFrame &#39;bay soporte de diapositivas </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> RÁPIDO Slide - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT cabra anti-ratón IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW cabra anti-conejo IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para el cáncer metastásico de células renales de células claras, el más común de variante de la enfermedad. Un factor clave en esta resistencia al tratamiento se cree que es la complejidad molecular de la enfermedad de 1. La terapia dirigida, tales como el inhibidor de la tirosina cinasa (ITC)-sunitinib han sido utilizados, pero sólo el 40% de los pacientes responderán, con la gran mayoría de estos pacientes que recaen dentro de 1 año 2. Por ello, la cuestión de la resistencia intrínseca y adquirida en pacientes renales de células cancerosas es muy relevante 3. Con el fin de estudiar la resistencia a TKIs, con el objetivo final de desarrollar tratamientos eficaces y personalizados, tejido secuencial después de un período específico de terapia dirigida se requiere, un enfoque que ha resultado exitoso en leucemia mieloide crónica 4. Sin embargo, la aplicación de esta estrategia en el carcinoma de células renales se complica por el alto nivel de bOTH inter e intratumoral heterogeneidad, que es una característica de carcinoma de células renales 5,6, así como otros tumores sólidos 7. Heterogeneidad Intertumoral debido a las diferencias transcriptomic y genética está bien establecida incluso en pacientes con presentación similar, estadio y grado del tumor. Además es evidente que existe un gran morfológica (intratumoral) heterogeneidad en RCC, que es probable que represente heterogeneidad molecular aún mayor. Mapa detallado y clasificación de los tumores RCC por análisis morfológico combinada y la clasificación de Fuhrman permite la selección de áreas representativas para el análisis proteómico. El análisis de proteínas basado en 8 de CCR es atractivo debido a su amplia disponibilidad en los laboratorios de patología, sin embargo, su aplicación puede ser problemática debido a la limitada disponibilidad de anticuerpos específicos 9. Debido a la naturaleza de dot blot de las matrices de la proteína de fase inversa (RPPA), la especificidad del anticuerpo debe be pre-validado; como tal control de calidad estricto de los anticuerpos utilizados es de suma importancia. A pesar de esta limitación, el formato de dot blot sí permite la miniaturización de ensayo, lo que permite la impresión de cientos de muestras en un portaobjetos de nitrocelulosa sola. Diapositivas impresas se pueden analizar de una forma similar a análisis de Western con el uso de anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, lo que permite la multiplexación. La expresión diferencial de proteínas en todas las muestras en un portaobjetos se pueden analizar simultáneamente al comparar el nivel relativo de fluorescencia de una manera más rentable y de alto rendimiento.

Un ejemplo de una diapositiva escaneada RPPA se puede ver en la Figura 4 (i) con dos canales 680 y 800 nm mostradas. La separación de las imágenes por longitud de onda, la Figura 4 (ii) permite a cada almohadilla en la diapositiva RPPA a analizar y expresión de la proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como se puede ver en la Figura 4 (iii) la expresión de las proteínas individuales en las muestras es único con gelsolina tiene un alto ni...

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The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA permite la expresión de la proteína de cientos de muestras, impresos en portaobjetos de nitrocelulosa para ser interrogado simultáneamente, usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta técnica se ha aplicado para estudiar el efecto de la heterogeneidad de tratamiento de drogas dentro de células claras carcinoma renal.

El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

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