Name: the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

Arbetet med författare FCO, DF, JN, DJH och GDS ovan finansieras av Chief Scientist kontoret, licensnummer: ETM37 och stöds av Cancer Research UK Experimentell Cancer Medicin Centre. Arbetet med AL finansieras av Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust för vård och bota cancer och Medicinska forskningsrådet. IO stöds av en Royal Society of Edinburgh skotska regeringens Fellowship samfinansieras av Marie Curie-åtgärderna och den brittiska Medical Research Council. Författarna vill tacka SCOTRRCC medsökande och medarbetare för deras nyttiga diskussioner om några av de ämnen som diskuteras i detta dokument.

1. Identifiering av morfologiska och molekylära tumör Heterogenitet <ol><li> Tumörer avlägsnades från -80 ° C frys och hölls på torr is. </li><li> Dela tumörer i sektioner av ungefär 1 cm 3. Kartlägga det ursprungliga läget för varje tumör sektion i förhållande till varandra och etikett med ett unikt namn. Förvara proverna i enskilda kryokärl vid -80 ° C tills redo för användning. </li><li> Coat prover i oktober och skär i en kryostat vid -22 ° C. </li><li> Prover färgades med hemato...

<ol>
	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter+and+intratumour+heterogeneity:+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma.">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49 (2012).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays.">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li><li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

Den RPPA metoden som presenteras här är en hög genomströmning alternativ till den allmänt använda, men jämförelsevis låg genomströmning western blot teknik proteinanalys. Metoden tillåter hundratals prover att vara semi-kvantitativt analyseras och jämförs samtidigt möjliggör direkt jämförelse av viktiga proteiner över ett brett urval av cellinjer och vävnadsprover. Multiplexering med olika antikroppar arter ytterligare ökning av effekt av tekniken så att flera antikroppar kan användas samtidigt. Ex...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> aprotinin </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> fosfatasinhibitor cocktail 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> fosfatasinhibitor cocktail 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> proteasinhibitorcocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey Blocking Buffer </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85.600 </td></tr><tr><td> Mikronät II robotic spotter </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame &quot;fyra fack hållare </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST Slide - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT Get anti-mus-IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW Get anti-kanin-IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

För närvarande finns ingen botande behandling för metastaserande klarcellig njurcellscancer, den vanligaste varianten av sjukdomen. En viktig faktor i denna behandling motstånd tros vara den molekylära komplexiteten av sjukdomen 1. Targeted therapy såsom tyrosinkinashämmare (TKI)-sunitinib har utnyttjats, men endast 40% av patienterna kommer att svara med den överväldigande majoriteten av dessa patienter fick återfall inom 1 år 2. Som sådan frågan om inneboende och förvärvad resistens i njurcancerpatienter är högst relevant 3. För att studera resistens mot TKIs, med det yttersta målet att utveckla effektiva och individuellt anpassade behandlingar är sekventiell vävnad efter en viss period av targeted therapy krävs en strategi som har visat sig vara framgångsrik i kronisk myeloisk leukemi 4. Men tillämpningen av en sådan strategi i njurcellscancer kompliceras av den höga bOTH tvär-och intratumoral heterogenitet, som är en funktion av njurcellscancer 5,6 samt andra solida tumörer 7. Intertumoral heterogenitet på grund av transcriptomic och genetiska skillnader är väl etablerad även hos patienter med liknande presentation, scen och grad av tumör. Dessutom är det tydligt att det finns en stor morfologiska (intratumoral) heterogenitet i RCC, som sannolikt kommer att representera ännu större molekylär heterogenitet. Detaljerad kartläggning och kategorisering av RCC tumörer genom kombinerad morfologisk analys och Fuhrman gradering möjliggör val av representativa områden för proteomik analys. Protein analys av RCC 8 är attraktiv på grund av dess omfattande tillgänglighet i patologi laboratorier, men kan tillämpningen vara problematisk på grund av den begränsade tillgången på specifika antikroppar 9. På grund av dot blot natur Reverse Arrays fasprotein (RPPA), antikroppar specificitet måste be förväg godkänd, som sådan strikt kvalitetskontroll av begagnade antikroppar är av största vikt. Trots denna begränsning dot blot-formatet gör att analysen miniatyrisering, vilket möjliggör tryckning av hundratals prover på en enda nitrocellulosa bild. Tryckta objektglas kan sedan analyseras på ett liknande sätt som Western-analys med användning av målspecifika primära antikroppar och fluorescent märkta sekundära antikroppar, vilket möjliggör multiplexering. Differentiellt proteinuttryck över alla prover på en slid kan sedan analyseras samtidigt genom att jämföra den relativa nivån av fluorescens i en mer kostnadseffektiv och hög genomströmning sätt.

Ett exempel på en scannad bild RPPA kan ses i figur 4 (i) med både 680 och 800 nm visas kanaler. Separera bilderna från våglängden, figur 4 (ii) kan varje pad på RPPA bilden som ska analyseras och individuella proteinuttryck bestämd Figur 4 (iii). Såsom kan ses i Figur 4 (iii) uttrycket av individuella proteiner över proverna är unik med Gelsolin har en hög nivå av expression över sliden jämfört med cMYC som har en mycket lägre proteinex...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers at JoVE.com

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA möjliggör proteinexpression av hundratals prover, tryckta på nitrocellulosa objektglas som skall utfrågas samtidigt, med fluorescensmärkta antikroppar. Denna teknik har tillämpats för att studera effekten av läkemedelsbehandling heterogenitet inom klarcellig njurkarcinom.

Användning av omvänd matriser Phase Protein (RPPA) att utforska Variation Protein Expression inom enskilda Renal Cell Cancer

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

Användning av en hängande vikt System för isolerade Renal artärocklusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Heterogenitet Kartläggning av Protein Expression i tumörer med hjälp av kvantitativa Immunofluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion och Detektering av reaktiva syreradikaler (ROS) i cancer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Rening och aggregation av amyloidprekursorproteinet intracellulära domänen

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Microarray-baserade Identifiering av individuella HERV Loci Expression: Anmälan till biomarkörer vid prostatacancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Tredimensionell kultur analys att utforska Cancer Cell invasiv och satellit tumörbildning

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Med In Vitro Live-cell Imaging att utforska kemoterapeutika levereras av Lipid-baserade nanopartiklar

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

En effektiv siktning metod att isolera intakt Glomeruli från vuxen råtta njure

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Precisions implementering av minimal erytem dos (MED) testning för att bedöma individuell variation i human inflammatorisk respons

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...