Name: the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00
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Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento para BAV da Fundação de Crohn e Colite do Canadá (CCFC) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). GB foi financiado por uma bolsa de estudo de pós-graduação a partir de CIHR. BAV é a crianças com distúrbios intestinais e do Fígado (filho) Cadeira Fundação de Pesquisa IBD Pediátrica e do Presidente de Pesquisa do Canadá em Gastroenterologia Pediátrica.

1. Preparação do inoculo e Citrobacter rodentium gavagem oral de ratos <ol><li> Preparar e autoclave caldo Luria Bertani (LB). </li><li> Obter C. viável rodentium a partir de um estoque de glicerol congelados e raia na placa LB agar usando um loop de inoculação estéril ou pipeta. Incubar a 37 ° C durante a noite. Inocular 3 ml de caldo LB estéril num tubo de cultura com falcon colónias da placa LB usando uma ansa de inoculação ou a ponta da pipeta. Preparação do inoculo deve ser...

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Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de doenças infecciosas tanto em ratos e colite. Este modelo único permite a caracterização de ambas as respostas do hospedeiro, bem como as propriedades patogénicas de bactérias. As etapas descritas neste detalhe o protocolo de uso bem sucedido desse modelo. Há vários passos críticos neste protocolo para manter em mente quando induzir colite e analisar as respostas. Em primeiro lugar, a prepara?...

Infecção por agentes patogénicos bacterianos entéricos desencadeia a inflamação gastrointestinal (GI), bem como a patologia do intestino e fisiopatologia, incluindo a diarreia e disfunção da barreira epitelial intestinal. Os mecanismos de virulência de patógenos bacterianos que colonizam o trato gastrointestinal de seus hospedeiros, bem como respostas de acolhimento específicas que defendem contra essas infecções são mal compreendidos, no entanto avanços recentes na modelagem de infecções bacterianas entéricas começaram a ajudar o nosso entendimento desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Doença de Crohn IBDS (CD) e UC são doenças complexas de etiologia desconhecida, caracterizada pela inflamação intestinal crônica e dano tecidual. Muitos modelos de rato de inflamação intestinal existe, a partir de inflamação espontânea em estirpes geneticamente modificados, tais como a IL-10 - / - de ratos, aos desafios químicos com os compostos, tais como o sulfato de sódio de dextrano (DSS) e dinitrobenzene sulfico (DNBS) 1. Há a hipótese de que os desajustados respostas inflamatórias crônicas presentes em pacientes com DII desenvolver em indivíduos geneticamente susceptíveis após a exposição anormal do sistema imunológico da mucosa intestinal de bactérias entéricas 2, portanto, o estudo de modelos de colite infecciosa também oferece um potencial significativo para definir potencialmente patogênica anfitrião . respostas a bactérias entéricas Citrobacter rodentium colite induzida é um dos modelos de colite infecciosa raras que tem sido bem caracterizados 1,3, permitindo a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas e uma maior compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD, um passo essencial no desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa e anexando effacing (A / E), patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com o humano importantepatógenos enteropatogênica E. coli (EPEC) e E. enterohemorrágicas coli (EHEC) 3-8. A família de agentes patogénicos A / E intimamente anexar à membrana apical da célula hospedeira do epitélio do ceco e do cólon, formação de uma estrutura não-invasivo pedestal semelhante sobre a célula hospedeira. Desafio oral com C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produz um modelo robusto de colite infecciosa caracterizada por hiperplasia do cólon ou alongamento das criptas, infiltração de células mononucleares imunológico e esgotamento das células caliciformes 3,4. O sítio inicial da colonização, algumas horas após o desafio, é no remendo cecal, seguido de progressão para o cólon distai 2 a 3 dias após a infecção 3. Em estirpes de murganhos imunocompetentes, a depuração do agente patogénico é alcançado 3 a 4 semanas após a infecção 1,3,4. No entanto, muitas estirpes geneticamente modificados, ou seja deficiente ou gene knockout (- / -), ratinhos, foram encontrados para exibir aumensed susceptibilidade à infecção, resultando em danos exagerados e / ou infecção crónica e inflamação 9-14. A utilização deste modelo de colite infecciosa nessas estirpes knockout, muitas proteínas de sinalização deficiente inatas, tem sido indispensável para revelar proteínas hospedeiras várias integrais para a resolução da infecção e inflamação intestinal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Adicionar 25 g de pó de LB para 1L de água. Autoclave antes de usar. </td></tr><tr><td> Placa de fundo quadrado com grade </td><td> Pescador </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de cultura Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada derrubado agulha gavagem </td><td> Belas Science Tools </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 seringa ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido cítrico </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Citrato de sódio </td><td> Pescador </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Pescador </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido citrato dextrose </td><td></td><td></td><td> 20 mM de ácido ctiric, 110 mM de citrato de sódio, 5 mM de dextrose </td></tr><tr><td> Placa preta de 96 poços </td><td> Pescador </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Esferas de metal (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de formalina </td><td> Pescador </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de 5 ml </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Pescador </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Pescador </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> Pescador </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin tina de coloração </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão citrato de sódio </td><td></td><td></td><td> Citrato de sódio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Caneta pap </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cabra </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino (BSA) </td><td> Pescador </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> A azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de bloqueio </td><td></td><td></td><td> Soro de cabra a 2%, 1% de BSA, 0,1% de triton X-100, Tween 20 0,05% de sódio, 0,05%azida, 0,01 M PBS, pH 7,2, mistura e armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> De tampão de diluição de anticorpos </td><td></td><td></td><td> 0,1% de triton X-100, 0,1% de BSA, azida de sódio a 0,05%, EDTA a 0,04% </td></tr><tr><td> De tampão de diluição de anticorpo tampão de bloqueio e de tir </td><td></td><td></td><td> Receitas mesmos que acima, mas sem adição de detergentes (triton X-100 e Tween 20) </td></tr><tr><td> Prolongar Reagente Antifade ouro com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Pescador </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Incubação de bancada shaker </td><td> Barnstead Laboratório Linha </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrífuga 22R</td><td></td></tr><tr><td> Navio a vapor </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Este protocolo descreve os passos necessários para a produção de um modelo robusto de doença infecciosa e colite, bem como os métodos utilizados para caracterizar Citrobacter rodentium infecção em ratinhos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa, patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com a importância clínica humana patógenos enteropatogênica E. coli entero-e E. coli. Após a infecção com C. rodentium, ratos imunocompetentes sofrem de perda de peso modesta e transitória e diarréia. Histologicamente, alongamento cripta intestinal, infiltração de células imunes, e depleção de células caliciformes são observados. Eliminação da infecção é conseguida ao fim de 3 a 4 semanas. Medição da integridade da barreira epitelial intestinal, a carga bacteriana, ou de lesões histológicas em diferentes momentos após a infecção, permitiu a caracterização de estirpes de ratinho susceptíveis à infecção. O mecanismo de virulências por agentes patogénicos bacterianos, que colonizam o tracto intestinal de hospedeiros, bem como as respostas específicas de acolhimento que defendem contra essas infecções são pouco compreendidos. Por conseguinte, a C. rodentium modelo de infecção bacteriana entérica serve como uma ferramenta valiosa para ajudar a nossa compreensão desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Postula-se que as respostas inflamatórias crónicas adaptativos observados em pacientes com DII desenvolver, em indivíduos geneticamente susceptíveis, após a exposição anormal do sistema imune da mucosa intestinal de bactérias entéricas. Assim, o estudo de modelos de colite infecciosa oferece um potencial significativo para a definição de respostas do hospedeiro potencialmente patogénicos em bactérias entéricas. C. rodentium colite induzida é um tal modelo raro que permite a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas, promovendo a nossa compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD;essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.

Durante uma experiência de infecção padrão, os ratinhos são infectados com cerca de 2,5 x 10 8 UFC, pela via oral de 100 ul durante a noite C. cultura rodentium. Infecção de ratinhos C57BL / 6 com C. rodentium resultados na perda de peso modesta e transitória e diarréia. Embora uma ocorrência rara com C57BL / 6, os animais podem ficar doentes e necessitam de eutanásia. Portanto, os ratinhos devem ser monitorizados para o grau de perda de peso e os sintomas da aflição, t...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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