Name: giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2013-06-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Vi takker Bryan Venema og Eric Martinson for å konstruere electroformation apparat. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra National Institutes of General Medical Sciences av National Institutes of Health (R01GM100718 til SEG) og National Eye Institute for National Institutes of Health (R01EY017564 til SEG).

En. Nedfall av lipider fra Organiske løsemidler: Klassisk Protocol <ol><li> Fjerne lipider fra lagring ved -20 ° C eller -80 ° C, varm til RT. Forsiktig: lipider er ekstremt hygroskopisk, og mange er følsomme for oksygen. Dekk lipider i tørr argon eller nitrogen gass og i alle forholdsregler for å minimere eksponering til luft. </li><li> Hvis det er nødvendig, suspendere lipider i kloroform eller sykloheksan på 1-10 mg / ml, merk at produsentens oppgitte konsentrasjoner er vanligvis n...

<ol>
	<li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy.">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li><li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Giant Vesicles. , (2000).</li><li>Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes:+a+model+system+in+which+to+obtain+patch-clamp+recordings+of+ionic+channels.">Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.</a> Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+giant+unilamellar+vesicles.">Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles.</a> PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Manley, S., Gordon, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+giant+unilamellar+vesicles+via+hydration+of+a+lipid+film.">Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Progressin Colloid &amp; Polymer Science. 89, 127-131 (1992).</li><li>Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC-electric+field+dependent+electroformation+of+giant+lipid+vesicles.">AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).</li><li>Pott, T., Bouvrais, H., M&#233;l&#233;ard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+formation+under+physiologically+relevant+conditions.">Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions.</a> Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).</li><li>Sens, P., Isambert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undulation+Instability+of+Lipid+Membranes+under+an+Electric+Field.">Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field.</a> Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).</li><li>Green, N. G., Ramos, A., Gonz&#225;lez, A., Morgan, H., Castellanos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+induced+by+nonuniform+ac+electric+fields+in+electrolytes+on+microelectrodes.+I.+Experimental+measurements.">Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements.</a> Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dissolved+gases+in+high+-performance+liquid+chromatography.">The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).</li><li>Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+degassing+and+other+factors+affecting+liquid+chromatographic+detector+stability.">Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability.</a> J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).</li><li>Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Phase+Degassing-Why,+When,+and+How.">Mobile Phase Degassing-Why, When, and How.</a> LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).</li><li>Cheng, H., Jiang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+homeostasis+of+mouse+dorsal+root+ganglia+induced+by+apolipoprotein+E+deficiency:+a+shotgun+lipidomics+study.">Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study.</a> J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).</li><li>Rockland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Salt+Solutions+for+Static+Control+of+Relative+Humidity+between+5+&#176;+and+40+&#176;C.">Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 &#176; and 40 &#176;C.</a> Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).</li><li>Washburn, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).</li><li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes+in+physiological+buffer+using+electroformation+in+a+flow+chamber.">Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Peroxides+Promote+Large+Rafts:+Effects+of+Excitation+of+Probes+in+Fluorescence+Microscopy+and+Electrochemical+Reactions+during+Vesicle+Formation.">Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation.</a> Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+phosphatidylcholine+in+aqueous+liposome+dispersions.">Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions.</a> Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).</li><li>Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidation+of+polyunsaturated+phosphatidyl-choline+lipids+during+electroformation.">Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation.</a> Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).</li><li>Farkas, E. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+polarization+imaging+of+steady-state+molecular+order+in+ternary+lipid+vesicles+for+the+purpose+of+lipid+phase+assignment.">Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment.</a> J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).</li><li>Hauser, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ultrasonic+irradiation+on+the+chemical+structure+of+egg+lecithin.">The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).</li><li>Hauser, H., Cevc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicles.">Phospholipid vesicles.</a> Phospholipids Handbook. , (1993).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Kim, R. S., LaBella, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+analytical+methods+for+monitoring+autoxidation+profiles+of+authentic+lipids.">Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids.</a> J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).</li><li>Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+alter+miscibility+phase+boundaries+in+ternary+vesicles.">Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles.</a> J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).</li><li>Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

Electroformation av gigantiske liposomer har utviklet seg til en fleksibel teknikk kompatibel med ulike lipider, preparater og buffere. Med nøye kontroll av lipid avleiring prosess er mest avgjørende for suksess. Vi har presentert enkle verktøy for å lage kontrollert deponering av lipider fra små liposomoppløsninger forberedelser en grei prosess. Den relative fuktighet er kritisk for korrekt dehydrering av de opprinnelige liposomene, og den optimale verdi, vil variere med den opprinnelige konsentrasjon av de oppl?...

Giant liposomer (ofte kalt gigantiske unilamillære blemmer, eller Guvs) har først og fremst blitt brukt til å studere fysikk og fysikalsk kjemi av lipid bilayers, inkludert studier av bilayer deformasjon, lateral fase sameksistens (&quot;flåter&quot;), membran fusion, 1-4 etc. De har en grovt celle-lignende struktur: kuleskall av membranen som omgir en vandig indre som lett kan gjøres annerledes enn det omkringliggende vandig buffer. De er, per definisjon, ≈ 1-100 mikrometer i diameter, slik at de kan avbildes ved hjelp av en rekke lette mikroskopi tilnærminger. De kan være laget ved hjelp av stram osmotiske gradienter eller mekanisk påført spenning, slik at mens generelt myke, kan deres egenskaper bli manipulert for enkel håndtering. Spesielt styrer &quot;stivhet&quot; av liposomet gjør det enkelt å danne &quot;liposom-festet&quot; eller skåret lapper for elektrofysiologisk. I det siste, var ion-kanalen tilberedning i stor grad utført i planar lipid bilayers. Nå gjør evnen til å danne flekker fra gigantiske liposomer og bruker betydelige kogger av verktøy utviklet for konvensjonell electrophysiology (fluorescensmikroskopi, mikropipette aspirasjon, hurtig perfusjons-og temperaturkontroll, etc.) gigantiske liposomer stadig mer attraktivt for rekonstituering studier 5,6. Giant liposomer har blitt gjort av mange strategier. Faktisk gigantiske liposomer dannes spontant ved en svellende prosess når en tørket lipidfilm blir rehydrert 4,7,8. Ønsket om å raskere forberede større, ledet mer ensartede liposomer forskere til andre tilnærminger, høvding blant dem electroformation 1,9. Electroformation er også avhengig av hydratisering av en tørket lipidfilm, men hastigheter prosessen gjennom anvendelse av et oscillerende elektrisk felt på tvers av lipidfilmen. Feltet blir levert gjennom to elektroder, enten platina ledninger eller indium-tinn-oksyd (ITO) belagte glassplater, adskilt av vann ellerbuffer og hvorpå lipidene avsettes. Ved å påskynde hevelse av liposomer, oppnår man en høyere yield på større liposomer. Dermed har electroformation blitt standard metode for å produsere gigantiske liposomer fire. Mekanismen for electroformation er ikke fullt ut forstått, og det meste av protokoller er utviklet empirisk (f.eks 10,11). Likevel kan vi lære litt om hva du kan forvente ved å vurdere teori og noen empiriske resultater. Det er allment antatt at electroformation oppstår ved kjøring elektro-osmotisk flyt av buffer mellom individuelle lipid bilayers stablet i deponert lipidfilmen 10,11. Elektrostatisk kopling til termiske svingninger av lipid bilayers er trolig også involvert 12. Disse hypoteser kvalitativt forutsi øvre grenser for det elektriske felt frekvens og styrke som kan brukes 10,12. Spesielt er det spådd at høy ledningsevne løsninger ( <em&gt; det vil si fysiologisk saltvann) redusere electrohydrodynamic krefter som kan initiere liposomet electroformation 12. Electroosmotic gjennomstrømning generelt avtar med økende saltkonsentrasjon og er ofte toppet seg på noen elektriske feltet svingninger frekvens (f.eks om enn i en annen geometri, Green et al. 13). Dermed høyere feltstyrke og høyere frekvenser er rimelige for høy ledningsevne løsninger, innen visse grenser 10. Men membran proteiner er sannsynlig å være uforenlig med den vanlige metoden for deponering lipider på elektroder som electroswelling prosedyre, nemlig i organiske løsemidler som deretter fordampet av for å legge igjen en tynn lipid film. Det er to viktigste veier rundt dette problemet: å innlemme proteiner etter gigantisk liposomdannelse, eller for å tilpasse hvordan lipider er deponert. Vår tilnærming bygger på andre 5,11 til deponere lipider og reconstiinnstiftet membran protein sammen fra en suspensjon av små eller store &quot;proteoliposomes&quot;. Vi beskriver den lange og mer utfordrende prosess å produsere proteoliposomes fra renset protein og lipider andre steder (Collins og Gordon, i gjennomgang). Her beskriver protokollen i fravær av noe protein, men det er det samme når protein er innarbeidet, inkluderer vi resultater som viser at proteoliposomes inneholder ion-kanalen TRPV1 kan bli forvandlet til Guvs og brukes for patch-clamp elektrofysiologi. I alle electroformation tilnærming er visuell inspeksjon av lipid prøven under lipiddeponeringsraten prosessen avgjørende for suksess. Vår tilnærming kan være aktuelt utover spesialisert applikasjon til ion-kanalen tilberedning. I tiden siden vi først utviklet denne protokollen, og nå har det også blitt vist hvordan måten lipider er avsatt på elektroder for electroformation påvirker det kompositoriske heterogenitet av de resulterende Guvs. Baykal-Caglar et al. 14. viste at Guvs dannet av nøye dehydrerte liposomer hadde en 2,5 ganger mindre variasjon i blandbarheten omvandlingstemperatur av Guvs dannet fra blandinger av forskjellige fosfolipider og kolesterol. Deres arbeid viser at lipider, og spesielt kolesterol, kan utløse fra Lipidblandingen når avsatt fra organiske løsningsmidler, noe som resulterer i store romlige variasjonen i sammensetningen av det avsatte lipidfilmen. Dette er spesielt viktig for studier av lipid membran faseoppførsel, men kan også være avgjørende for kvantitative eksperimenter på ion-kanalen funksjon. Baykal-Caglar et al. &#39;S protokollen er like, men ikke identisk med vår egen, og leserne oppfordres til å studere det også. Denne protokollen (se oversikt, figur 1) er en av mange som kan brukes. I prinsippet electroformation suksess avhengig av lipid-blanding, hydrering, temperatur, andre oppløste stoffer (spesielt ioner), og avSelvfølgelig den spenning og frekvens som brukes i formasjonen. Som electroformation blir bedre forstått, forventer vi å forbedre vår protokoll mer. Til slutt er det ofte en bratt læringskurve i electroforming gigantiske liposomer. Vi foreslår å mestre den konvensjonelle protokoll (§ § 1 og 4, og, om nødvendig, seksjon 5) før du lære å sette lipider fra liposomale suspensjoner (§ 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

Tilberedning av ionekanaler i kjemisk definerte lipid membraner for elektrofysiologisk registrering har vært en kraftig teknikk for å identifisere og utforske funksjonen til disse viktige proteiner. Men klassiske preparater, som for eksempel planar bilayers, begrense manipulasjoner og eksperimenter som kan utføres på den rekonstituerte kanalen og dens membran miljø. Jo mer celle-lignende struktur av gigantiske liposomer tillater tradisjonelle patch-clamp eksperimenter uten å ofre kontroll av lipidsystemet miljø. Electroformation er en effektiv måte til å produsere store liposomer&gt; 10 pm i diameter, som er avhengig av anvendelsen av vekselspenning til en tynn, bestilte lipidfilm avsatt på en elektrodeoverflate. Imidlertid, siden den klassiske protokollen krever lipidene for å bli deponert fra organiske oppløsningsmidler, er det ikke er kompatibel med mindre robuste membranproteiner som ionekanaler og må modifiseres. Nylig, protocols har blitt utviklet for å electroform gigantiske liposomer fra delvis dehydrert små liposomer, som vi har tilpasset seg protein-holdige liposomer i vårt laboratorium. Vi presenterer her bakgrunnen, utstyr, teknikker og fallgrubene electroformation av gigantiske liposomer fra små liposomoppløsninger dispersjoner. Vi begynner med den klassiske protokollen, som skal mestres først før du prøver de mer utfordrende protokoller som følger. Vi viser prosessen med kontrollert partiell dehydratisering av små liposomer ved hjelp av damp likevekt med mettede saltløsninger. Endelig viser vi prosessen med electroformation selv. Vi vil beskrive enkel, billig utstyr som kan gjøres internt for å produsere høykvalitets liposomer, og beskrive visuell inspeksjon av preparatet på hvert trinn for å sikre de beste resultatene.

I vårt eksempel, forbereder vi liposomer fra en blanding av omtrent 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfocholin), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserine , 30 mol% kolesterol, og 0,1 mol% Texas Red-merket 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoethanolamine (TXR-DPPE). Denne sammensetningen ble valgt som ca representant for dorsal root ganglion lipider 18. Vi merker oss at 15 mol% ladet lipid (her POPs) er nær grensen for hva som kan brukes i electroformation <...

Watch this Scientific Journal Video about Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Reconstituting funksjonelle membran proteiner i gigantiske liposomer definert sammensetning er en kraftig tilnærming når det kombineres med patch-clamp elektrofysiologi. Imidlertid kan konvensjonell gigantisk liposomen produksjonen være uforenlig med protein stabilitet. Vi beskriver protokoller for å produsere gigantiske liposomer fra rene lipider eller små liposomer som inneholder ionekanaler.

Giant Liposome Forberedelse til Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Exploring Arteriell glatt muskulatur KV7 Kalium Channel funksjon ved hjelp Patch Clamp Elektrofysiologi og trykk Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Tilberedning av et trans Protein, den Spenning ionekanal, KvAP, inn Giant unilamellær Blemmer for Mikros og Patch Clamp Studier

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...