Name: introduction to solid supported membrane based electrophysiology
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

نشكر J. جارسيا لسيلما، أنا سميرنوفا وR. Kaback من أجل التبرع لقياسات المزركشة وE. بامبرج للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة.

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

1. مزايا الكهربية المستندة إلى SSM بالمقارنة مع الطرق التقليدية وقد ثبت الكهربية المستندة إلى SSM نفسها كأداة قيمة من مربع الأدوات الكهربية. انها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي لا يمكن فيها تطبيق اتفاقية الكهربية، وهي المشبك التصحيح وطرق المشبك الجهد، و: وبصرف النظر عن بعض الاستثناءات النادرة نقل البكتيرية لا يمكن التحقيق باستخدام المشبك الجهد أو أساليب المشبك التصحيح بسبب صغر حجم البكتيريا، ولأن أنها صعبة للتعبير في خلايا الثدييات أو البويضات. ولكن أيضا من الناحية الفسيولوجية نقل الثدييات ذات الصلة يمكن التحقيق. في هذه الحالة الكهربية المستندة إلى SSM جذابة للنقل من أغشية الخلايا وللتطبيقات الفحص في اكتشاف المخدرات بسبب متانة وقدرته على التشغيل الآلي. SSM-basedUsing التقليدية الكهربية، والوقت توصيف حل من TRANSPorters يمثل تحديا. منذ دوران ناقلات منخفضة A &#39;التصحيح العملاقة&#39; أو مطلوب التكوين &#39;خلية كاملة &quot;، والتي يكون لها القرار وقت منخفضة بطبيعتها في تجربة تبادل الحلول. ويمكن التغلب على المضاعفات باستخدام الإفراج الركيزة التحلل الضوئي. ومع ذلك، هي مناسبة فقط لعدد محدود من ركائز لهذا النهج. هنا تبادل حل سريع في SSM يوفر فرصة فريدة لإجراء دراسات الكهربية مع قرار الأوان باستخدام ركائز التعسفي. 2. القيود والخطوات الحاسمة وعلى النقيض من المشبك التصحيح وتقنيات المشبك الجهد، لا يمكن الكهربية المستندة إلى SSM استخدامها لتطبيق المحتملة. ولذلك يقتصر توصيف نقل لنقل وسائط التي لا تعتمد على غشاء المحتملة. بشكل عام، الكهربية المستندة إلى SSM لا يوجد لديه قيود تتعلق بنوع الناقل (كهربي). ولكن CL الجهديمكن أن أساليب المشبك أمبير أو التصحيح لديها مزايا، إذا كانت هناك حاجة مكونات داخل الخلايا مثل البروتينات ملزمة حصول على وظائف البروتين. يمكن أن تنشأ القيود، إذا تبادل حل يخلق تيارات قطعة أثرية كبيرة. يحدث هذا عندما يتفاعل بقوة مع الركيزة SSM مثل في حالة مركبات محبة للدهون. ضوابط قطعة أثرية يمكن استخدامها لتصحيح الإشارات المقاسة. خلفية عالية من الملح علاوة على ذلك في جميع مخازن قياس يمكن استخدامها للحد من القطع الأثرية. ولكن في حالات، حيث حجم قطعة أثرية مشابه لإشارة البروتين، فإنه يكاد يكون من المستحيل عزل إشارة ذات صلة البروتين من القطع الأثرية. لحسن الحظ، والتحف عالية غير عادية في تبادل حل الأمثل. هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح في تجربة الكهربية المستندة إلى SSM. إعداد نموذج البروتين هو الجزء الأكثر أهمية. إذا تم استخدام proteoliposomes، تأكد من أن reconsعملية titution غلة نظيفة، عينة استنساخه من LPR كافية ونقل هو المنحى في الطريق الصحيح. وLPR يمكن فحصها من قبل تجميد كسر المجهر الإلكتروني والتوجه تجربة ELISA إذا كانت الأجسام المضادة المتاحة. لا تستخدم سوى SSM مما يدل على المعلمات الأمثل لاحتضان العينة البروتين. حقن هذا البروتين هو خطوة حاسمة أخرى. صوتنة ضروري وينبغي تجنب فقاعات الهواء أثناء الحقن. بعد مرور فترة الحضانة عينة القياسات نفسها هي الحاسمة، لأن فقاعات الهواء سيزيل عينة بروتين كثف من رقاقة الاستشعار. لذلك دائما إزالة فقاعات الهواء بعد تغيير الحلول. ومع ذلك يمكن أن يحدث المتهدمة إشارة. لتصحيح ممكن المتهدمة إشارة، فإنه من الضروري لإنجاز الضوابط المتهدمة أثناء التجربة. 3. الأنظمة المتخصصة يمكن تعديل الإعداد SSM وفقا لتطبيقه. وعلاوة على ذلك رهنا مختلفة تماما الاجهزة درجة عالية من التخصص المتاحة،. هناك إمكانية لقياس إشارات البروتين في ظل ظروف غير متكافئة، على سبيل المثال في إطار التدرج درجة الحموضة. لإنشاء التراكيب العازلة غير المتكافئة داخل وخارج proteoliposomes حل ثالثا، الحل يستريح، لابد من عرضه وهذا يتطلب تكوين Exchange مزدوجة. هنا لا بد من وضع صمام ثلاثي إضافية التبديل بين حلول غير تفعيل ويستريح. لزيادة دقة الوقت للنظام وضعنا مسارا تدفق البديلة تفتقر إلى صمام محطة، ولكن باستخدام نوع مختلف من كفيت. هنا يقع على تقاطع تفعيل وحل غير تفعيل داخل كفيت، 3 ملم أمام SSM. هذا الإعداد هو مناسبة تماما لتحليل الحركية من عمليات النقل السريعة. ويمكن أن يتبين من ذلك أن القرار وقت منخفضة تصل إلى 2 ميللي ثانية هو ممكن. و التجاريةمع ully تتوفر النظم الآلية تهدف إلى إنتاجية أعلى بكثير لفحص المخدرات. وحدة منقولة بجمع الحلول ويحقن لهم على سطح جهاز الاستشعار في لوحات 96 بئر في شكل وحة microtiter القياسية.

نحن هنا لشرح نهج الكهربية جديدة تقوم على غشاء الصلبة المدعومة (SSM) لتوصيف البروتينات الغشاء كهربي. يتكون دعم قوي من طبقة رقيقة من الذهب على شريحة زجاجية، ورقاقة الاستشعار. يتم استخدام سطح ماء الذهب لربط مجموعة ثيول من كاشف alcanethiol. بعد ذلك، selfassembly من monolyer فسفاتيديل اكتمال تشكيل SSM. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM (الشكل 1). البروتين تحتوي على غشاء وSSM ثم تشكيل نظام غشاء جانب capacitively. ولذلك، إزفاء المسؤول في البروتين تحتوي على غشاء يمكن الكشف عنها بواسطة اقتران بالسعة عن طريق SSM. هذه الطريقة تعطي فقط تيارات عابرة. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. الساعة تعتمد مكعب نقلrrents يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر. هي التي شنت على رقاقة الاستشعار في نظام كفيت (الشكل 2). كفيت لديها حجم كفيت اسطواني من 17 ميكرولتر (الحجم الصافي مع O-حلقة شنت). A دبوس الاتصال الربيع يخلق الاتصال إلى مكبر للصوت. هو مشدود موصل منفذ إلى الجزء العلوي من الجزء الرئيسي ويحمل الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة. هي التي شنت كفيت في قفص فاراداي. توصيله إلى مسار السائل، والذي يستخدم للحث على نشاط النقل من البروتين غشاء ردا على تبادل حل سريع (الشكل 3). في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، يطلب من واحد غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة صمام على الكمبيوتر أو التبديل دليل على واجهة مربع.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

وتستند هذه الطريقة الكهربية التي نعرضها على غشاء بدعم الصلبة (SSM) تتألف من طبقة octadecanethiol chemisorbed على الذهب المطلي رقاقة الاستشعار وأحادي الطبقة فسفاتيديل على القمة. هي التي شنت هذه الجمعية في نظام كفيت يحتوي على الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة. بعد امتصاص شظايا غشاء أو proteoliposomes يحتوي على بروتين غشاء من الفائدة، يتم استخدام تبادل حل سريع للحث على نشاط النقل من البروتين الغشاء. في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، وهناك حاجة واحدة غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط ونظام صمام والأنابيب داخل قفص فاراداي. يتم الحصول على حركية ونشاط النقل كهربي عبر اقتران بالسعة بين SSM وproteoliposomes أو شظايا غشاء. الأسلوب، وبالتالي، ينتج transien فقطر التيارات. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. التيارات الوقت نقل تعتمد يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر. يناسب هذا الأسلوب وخاصة بالنسبة للنقل بدائية النواة أو نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، والتي لا يمكن التحقيق من قبل المشبك التصحيح أو أساليب المشبك الجهد.

حتى الآن، تم استخدام الكهربية المستندة إلى SSM لتوصيف أكثر من 20 الناقلون، معظمهم من أصول بدائية النواة، على سبيل المثال ميلب 3، NhaA 4 و 5 PutP (تلخيصها في 6). ولكن أيضا نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، على سبيل المثال ClC7 7 وكذلك القنوات الأيونية، على سبيل المثال تم التحقيق مستقبلات أستيل النيكوتينيك 8. هنا نقدم كمثال على قياسات السكر / H + cotransporter لاسي من الإشريكية القولونية باستخدام proteoliposomes مع الجانب الأيمن لا يقل عن 85٪ من التوجه لاسي في LPR من 5 9، 10. ونحن نركز على الخطوات الرئيسية المؤدية إلى الحد الأدنى من نموذج الحركية من هذا البروتين النقل. 1. توصيف الكهربية من لاسي wildtype الخطوة الأولى هي توصيف العام للرد فعل كهربي عن طريق قياس قيم درجة الحموضة مختلفة ( <strong<html> &gt; الشكل 4)، وتركيزات الركيزة (الشكل 5) وركائز. للتحقق من صحة هذه التقنية، واستنسخت K M والقيم PK بالنظر في الأدب. اعتماد الرقم الهيدروجيني للاسي يظهر اثنين من ردود الفعل كهربي مختلفة. الزيادات الحالية إلى جانب capacitively بين درجة الحموضة ودرجة الحموضة 8.5 5، ولكن أيضا إلى تغيير شكله. تحت ظروف قلوية ويلاحظ نقل حالة مستقرة، في حين أن الرقم الهيدروجيني الحمضية القيم فقط يبقى رد فعل كهربي السريع. لتمييز الإشارات حالة مستقرة من ردود فعل كهربي سريع استخدمنا تحليل الدوائر لإعادة بناء التيارات نقل (الشكل 6). في درجة الحموضة 7 يصبح إشارة الطور ثنائي الطور. هذا يشير ايضا الى ان هناك نوعان من ردود الفعل كهربي مختلفة. يقدر من تهمة نقل (يتجزأ من الإشارات)، وردود الفعل لهما حوالي 6٪ و 94٪ من electrogenicity الإجمالية للدورة النقل. ove_step &quot;&gt; 2. التنازل عن ردود فعل كهربي لتعيين اثنين من ردود فعل كهربي إلى خطوات معينة في دورة رد فعل من لاسي، تم قياس متغير لاسي E325A (الشكل 7). هذا البديل لا يظهر الا تبادل اللاكتوز ولكن منقوصة لجميع وسائل النقل النشط، وذلك بسبب تثبيط إطلاق بروتون. إشارة من E325A اسي يمثل عابر سريع وثابت لجميع قيم الرقم الهيدروجيني قياس. الشكل والسعة للإشارة مشابه لإشارة من wildtype لاسي في ظل الظروف الحمضية. وبالإضافة إلى ذلك نلاحظ مرحلة سلبية صغيرة بعد انخفاض الذروة الحالية، والذي هو سمة لتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively. لأن اللاكتوز ملزمة والإفراج ليس كهربي، وسريع عابر يجب ربط مع الانتقال بتكوين جزئي كهربي بعد اللاكتوز ملزمة. ومن المعروف أن الخطوة الافراج بروتون هو معدل limitiنانوغرام للدوران لاسي في الانحدار وضع اللاكتوز تركيز النقل مدفوعة. في هذه الحالة نحن نتوقع زيادة في معدل النقل مع درجة الحموضة القلوية، لأنه يفضل إطلاق بروتون. هذا هو الحال بالنسبة لنقل حالة مستقرة ترتبط إشارة من wildtype المزركشة. وعلاوة على ذلك يمكن أن تظهر من قبل قياس درجة الحموضة التدرج الا ان درجة الحموضة الداخلية يؤثر على نقل حالة مستقرة من لاسي (غير منشورة). ولذلك يمكن تعيين رد فعل كهربي كبير إلى الخطوة الافراج البروتون. 3. قياسات لتحليل الحركية بعد التعرف على ردود فعل كهربي داخل وخارج أسعار النقل تم تحديد باستخدام الإعداد SSM مع قرار الأوان من حوالي 4.5 ميللي ثانية. هذا ممكن فقط في ظل ظروف، عندما يهيمن رد فعل واحد إشارة. في هذه الحالة يمكن أن تستمد الثوابت معدل من التيارات عابرة تحت النظر في القرار وقت من الإشارات باستخدام تكرارية المربعات الصغرى دي<html> خوارزمية الإلتواء (الشكل 8). الثوابت معدل العزم وكذلك الحد الأدنى من نموذج الحركية المقترح (الشكل 9) واستخدمت أخيرا لمحاكاة حركية نقل. منحنيات محاكاة إنتاج البيانات SSM وهو ما يثبت بالإضافة إلى ذلك النموذج الحركية. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> الشكل 1. الامتزاز هندسة proteoliposomes على SSM. ويتكون SSM على رقاقة الاستشعار، والذهب منظم المغلفة شريحة زجاجية. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM. الأغشية اثنين من تشكيل نظام يقترن capacitively. هذا هو السبب في الكشف عن تيارات عابرة فقط. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. وSSM كفيت يحمل رقاقة الاستشعار والإلكترود المرجعي. محصورة رقاقة الاستشعار بين قاعدة كفيت ورئيس كفيت. يتم عزل القطب المرجع من مسار تدفق بواسطة مادة هلامية جسر الملح بولكرلميد. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="الشكل (3)" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> الشكل (3). المسار السوائل والدائرة الكهربائية من إعداد SSM. في البروتوكول تبادل حل واحد ومطلوب واحد فقط غير المفعل (NA) وتفعيل واحد (A) حل. يتم التحكم في تدفق من قبل اثنين من الصمامات 2 في اتجاه (V1) وصمام محطة واحدة (V2). رموز تبديل صمام محطة بين الحلول غير تفعيل وتنشيط وتوجيه واحدة من الحلول لكفيت والحل الآخر إلى حاوية النفايات (W). يتم توصيل رقاقة الاستشعار (SSM) إلى مكبر للصوت (I / U)،<html> في حين يتم توصيل القطب المرجعي (أجكل) إلى وظيفة مولد (F) في الدائرة الكهربائية الخارجية. ويستخدم جهاز الكمبيوتر (PC) ومربع واجهة للتشغيل صمام والحصول على البيانات. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> الشكل 4. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز على قيم درجة الحموضة مختلفة. الحل غير تفعيل الواردة الجلوكوز 100 ملم بينما يحتوي الحل تفعيل 100 ملي اللاكتوز. تم إعداد جميع الحلول في 100 ملي العازلة الفوسفات البوتاسيوم في درجة الحموضة المشار إليه مع 1 ملي DTT. للحصول على تفاصيل من شروط القياس في هذا والأرقام التالية يرجى الرجوع إلى 9 و 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 5. بلغ متوسط ​​التيارات الذروة تطبيع قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد يقفز تركيز اللاكتوز بتركيزات مختلفة وقيم درجة الحموضة. ويتم الحصول على القيم K M من نوبات القطعي. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="الشكل (6)" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> الشكل (6). إعادة الإعمار من التيارات نقل. التيارات عابر (A) استخدامها لإعادة بناء التيارات نقل (B) تم قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز في درجة الحموضة 8.5 (تتبع الأزرق) ودرجة الحموضة 5.2 (التتبع الحمراء). في الرقم الهيدروجيني لوحظ 8.5 دوران مستمر بينما عند pH 5.2 حدوث رد فعل كهربي سريع. ويلاحظ هذا بشكل واضح في التيار أعيد بناؤها (B). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 7 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 4IN &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. الحالية عابرة يقاس مع E325A proteoliposomes لاسي بعد ملي اللاكتوز الانتقال تركيز 100 في درجة الحموضة 5.2. هذا البديل لاسي هو تحول دون في خطوة الافراج بروتون من دورة النقل وبالتالي النقل التي تعاني من نقص. المكون السلبية الصغيرة احظ هو سمة للتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively ويسببه تصريف السعة غشاء بعد رد فعل كهربي سريع. يتم تحديد وقت لها π0 مستمرة من جانب السعة والمواصلة للنظام (الشكل 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="الرقم 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> الرقم 8. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد عملية الشراءويلاحظ R مختلفة يقفز تركيز اللاكتوز في درجة الحموضة 5.2. في ظل هذه الظروف لا نقل حالة مستقرة، ولكن انتقال متعلق بتكوين كهربي على اللاكتوز ملزمة. يظهر خط متقطع وظيفة النقل التي تمثل القرار وقت للنظام. وأقحم يظهر عزم وإيقاف ثوابت معدل من الملاحظ kobs ثابت معدل مع نوبة القطعي للبيانات. تم تحديد ثابت المعدل المرصود من التيارات عابرة مع تكرارية المربعات الصغرى deconvolution خوارزمية 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="الرقم 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> الشكل 9. يمكن التعرف على نموذج الحركية للدورة رد فعل من لاسي. خطوتين كهربي وتتميز القياسات SSM. رد فعل كهربي بقوة يمثلون ~ 94٪ من إجمالي النزوح تهمة في رد فعللوحظ دورة إلا عند قيم الرقم الهيدروجيني محايدة والقاعدية. يمكن أن تسند إلى خطوة الإفراج البروتون (السهم الأزرق). ويلاحظ وجود خطوة كهربي ضعيف في درجة الحموضة الحمضية عندما يتم تحول دون دوران مستمر من النوع البري لاسي. نحن تعيين هذا رد فعل على عملية انتقال بتكوين جزئي كهربي على اللاكتوز ملزم، وهو ما يمثل 6٪ من إجمالي النزوح تهمة في دورة التفاعل.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

تطبيق على microfluidics لالكهربية

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Spinal Cord Electrophysiology

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

اللوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في انواع معينة ايليجانس</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

في دراسة لالإلتقام وإعادة غشاء البلازما من البروتينات القائم على خلية L-الجلوتاثيون حماية فحوصات

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...