Name: introduction to solid supported membrane based electrophysiology
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00
Duration: 19 min 56 s
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हम समर्थन और उपयोगी विचार विमर्श के लिए लैस माप और ई. Bamberg के लिए योगदान के लिए जे गार्सिया-Celma, मैं Smirnova और आर Kaback धन्यवाद.

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

1. एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लाभ पारंपरिक तरीकों की तुलना एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी electrophysiological उपकरण बॉक्स के एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में खुद को साबित किया. यह सम्मेलन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, अर्थात् पैच दबाना और वोल्टेज दबाना तरीकों, लागू नहीं किया जा सकता है, जहां के मामलों में विशेष रूप से उपयोगी है: के अलावा कुछ दुर्लभ अपवाद से बैक्टीरियल ट्रांसपोर्टरों क्योंकि बैक्टीरिया के छोटे आकार के और क्योंकि वोल्टेज दबाना या पैच दबाना तरीकों का उपयोग कर जांच की जा नहीं सकते वे स्तनधारी कोशिकाओं या oocytes में व्यक्त करना मुश्किल है. लेकिन यह भी physiologically प्रासंगिक स्तनधारी ट्रांसपोर्टरों की जांच की जा सकती है. इस मामले में एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी intracellular झिल्ली से और क्योंकि इसकी मजबूती और स्वचालन के लिए अपनी क्षमता की दवाओं की खोज में स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए ट्रांसपोर्टरों के लिए आकर्षक है. Transp का एसएसएम-basedUsing पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, समय हल लक्षण वर्णनorters में चुनौती दे रहा है. ट्रांसपोर्टरों का कारोबार कम है के बाद से एक &#39;विशाल पैच&#39; या &#39;एक पूरे सेल&#39; विन्यास की आवश्यकता है, एक समाधान विनिमय प्रयोग में एक स्वाभाविक कम समय संकल्प है जो. जटिलता photolytic सब्सट्रेट रिहाई का उपयोग कर दूर किया जा सकता है. हालांकि, substrates के केवल एक सीमित संख्या में इस दृष्टिकोण के लिए अनुकूल हैं. यहाँ एसएसएम में तेजी से समाधान विनिमय मनमाना substrates का उपयोग एक उच्च समय संकल्प के साथ electrophysiological अध्ययन के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. 2. सीमाओं और महत्वपूर्ण कदम पैच दबाना और वोल्टेज दबाना तकनीक के विपरीत, एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक संभावित लागू करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. ट्रांसपोर्टर लक्षण वर्णन इसलिए एक झिल्ली क्षमता पर भरोसा नहीं है जो मोड परिवहन के लिए प्रतिबंधित है. सामान्य में, एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (electrogenic) ट्रांसपोर्टर के प्रकार के विषय में कोई सीमा नहीं है. लेकिन वोल्टेज सीएलबंधनकारी प्रोटीन की तरह intracellular घटकों प्रोटीन कार्यक्षमता के लिए आवश्यक हैं amp या पैच दबाना तरीकों, लाभ हो सकता है. समाधान विनिमय बड़े विरूपण साक्ष्य धाराओं बनाता है तो सीमाएं, पैदा कर सकते हैं. सब्सट्रेट lipophilic यौगिकों के मामले में तरह एसएसएम के साथ मजबूती से सूचना का आदान प्रदान जब यह होता है. विरूपण साक्ष्य नियंत्रण मापा संकेतों को सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी मापने बफ़र्स में इसके अलावा उच्च नमक पृष्ठभूमि कलाकृतियों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन मामले में, विरूपण साक्ष्य के आकार प्रोटीन संकेत के बराबर है, जहां यह विरूपण साक्ष्य से प्रोटीन संबंधित संकेत अलग करने के लिए लगभग असंभव है. सौभाग्य से, उच्च कलाकृतियों एक अनुकूलित समाधान विदेशी मुद्रा में असामान्य हैं. एक एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग के सफल वसूली के लिए महत्वपूर्ण हैं जो कुछ कदम उठाए हैं. प्रोटीन के नमूने की तैयारी सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है. Proteoliposomes इस्तेमाल कर रहे हैं, तो सुनिश्चित हो reconstitution प्रक्रिया एक पर्याप्त LPR के एक स्वच्छ, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूना पैदावार और ट्रांसपोर्टर सही तरीके से उन्मुख है. एंटीबॉडी उपलब्ध हैं LPR एक एलिसा प्रयोग से फ्रीज फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और अभिविन्यास द्वारा जाँच की जा सकती. केवल प्रोटीन नमूना incubating के लिए इष्टतम मापदंडों से पता चलता है जो एक एसएसएम का उपयोग करें. प्रोटीन के इंजेक्शन के एक और महत्वपूर्ण कदम है. Sonication आवश्यक है और हवा के बुलबुले इंजेक्शन के दौरान से बचा जाना चाहिए. हवाई बुलबुले सेंसर चिप से adsorbed के प्रोटीन के नमूने निकाल देंगे क्योंकि नमूना ऊष्मायन के बाद माप ही, महत्वपूर्ण हैं. इसलिए हमेशा समाधान बदलने के बाद हवाई बुलबुले को दूर. फिर भी एक संकेत ठहरनेवाला हो सकता है. एक संभव संकेत ठहरनेवाला ठीक करने के लिए इसे प्रयोग के दौरान ठहरनेवाला नियंत्रण हासिल करने के लिए आवश्यक है. 3. विशेष सिस्टम एसएसएम-सेटअप अपने आवेदन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा टीयहां उपलब्ध पूरी तरह से अलग, अति विशिष्ट सेटअप के हैं. एक पीएच ढाल के तहत जैसे विषम परिस्थितियों में प्रोटीन संकेतों को मापने के लिए संभावना नहीं है. एक तिहाई समाधान के अंदर और proteoliposomes बाहर विषम बफर रचनाओं की स्थापना करने के लिए, आराम समाधान, पेश किया जाना है और यह एक डबल विनिमय विन्यास की आवश्यकता है. यहाँ गैर सक्रिय और आराम समाधान के बीच स्विच एक अतिरिक्त तीन तरह वाल्व की आवश्यकता है. हम टर्मिनल वाल्व की कमी है, लेकिन क्युवेट के एक अलग प्रकार का उपयोग करते हुए एक विकल्प के प्रवाह मार्ग विकसित प्रणाली के समय संकल्प को बढ़ाने के लिए. यहाँ सक्रिय और गैर सक्रिय समाधान के जंक्शन एसएसएम के सामने 3 मिमी, क्युवेट अंदर स्थित है. इस सेटअप में अच्छी तेजी परिवहन प्रक्रियाओं की गतिज विश्लेषण के लिए अनुकूल है. यह 2 मिसे के रूप में कम के रूप में एक समय संकल्प संभव है कि दिखाया जा सकता है. वाणिज्यिक चully स्वचालित प्रणाली दवा स्क्रीनिंग के लिए एक काफी उच्च throughput पर निशाना उपलब्ध हैं. एक जंगम इकाई समाधान इकट्ठा और एक मानक microtiter प्लेट प्रारूप में 96 अच्छी तरह प्लेटें में संवेदक सतह पर उन्हें इंजेक्शन.

यहाँ हम electrogenic झिल्ली प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए एक ठोस समर्थित झिल्ली (एसएसएम) पर आधारित एक नया electrophysiological दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. ठोस समर्थन का एक गिलास स्लाइड, सेंसर चिप पर एक सोने की पतली परत के होते हैं. हाइड्रोफिलिक सोने की सतह एक alcanethiol अभिकर्मक की thiol समूह बाध्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बाद में, selfassembly एक phosphatidylcholine monolyer की एसएसएम के गठन को पूरा करता है. झिल्ली प्रोटीन की electrogenic प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, proteoliposomes या झिल्ली टुकड़े एसएसएम (चित्रा 1) के लिए adsorbed रहे हैं. झिल्ली और एसएसएम युक्त प्रोटीन तो एक capacitively युग्मित झिल्ली प्रणाली के रूप में. इसलिए, प्रोटीन युक्त झिल्ली पर आरोप स्थानान्तरण एसएसएम के माध्यम से capacitive युग्मन से पता लगाया जा सकता है. यह पद्धति केवल क्षणिक धाराओं पैदावार. मौजूदा शिखर स्थिर परिवहन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. समय निर्भर ट्रांसपोर्टर घनrrents सर्किट विश्लेषण से खंगाला जा सकता है. सेंसर चिप एक क्युवेट प्रणाली (चित्रा 2) में मुहिम शुरू की है. क्युवेट 17 μl के एक बेलनाकार क्युवेट मात्रा है (O-अंगूठी के साथ शुद्ध मात्रा घुड़सवार). एक वसंत संपर्क पिन एम्पलीफायर से संपर्क बनाता है. एक दुकान योजक मुख्य भाग के शीर्ष करने के लिए दबाव डाला और संदर्भ इलेक्ट्रोड, एक क्लोरीनयुक्त चांदी के तार किया जाता है. क्युवेट एक फैराडे पिंजरे में रखा है. यह एक तेजी से समाधान एक्सचेंज (चित्रा 3) के जवाब में झिल्ली प्रोटीन के परिवहन गतिविधि को प्रेरित किया जाता है जो एक तरल पदार्थ मार्ग से जुड़ा है. एकल समाधान विनिमय प्रोटोकॉल दो समाधान में, एक गैर सक्रिय और एक सक्रिय समाधान की आवश्यकता होती है. प्रवाह एक अंतरफलक बॉक्स पर एक कंप्यूटर या मैनुअल स्विच पर एक वाल्व नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दबाव हवा के द्वारा नियंत्रित किया जाता है.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

हम वर्तमान electrophysiological विधि एक सोने लेपित सेंसर चिप और शीर्ष पर एक phosphatidylcholine monolayer पर chemisorbed एक octadecanethiol परत से बना एक ठोस समर्थित झिल्ली (एसएसएम) पर आधारित है. इस विधानसभा संदर्भ इलेक्ट्रोड, एक क्लोरीनयुक्त चांदी तार युक्त क्युवेट प्रणाली में मुहिम शुरू की है. झिल्ली टुकड़े या ब्याज की झिल्ली प्रोटीन युक्त proteoliposomes की सोखना के बाद, एक तेजी से समाधान विनिमय झिल्ली प्रोटीन के परिवहन गतिविधि को प्रेरित किया जाता है. एकल समाधान विनिमय प्रोटोकॉल दो समाधान में, एक गैर सक्रिय और एक सक्रिय समाधान की जरूरत है. प्रवाह एक फैराडे पिंजरे के भीतर दबाव हवा और एक वाल्व और ट्यूबिंग प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जाता है. electrogenic परिवहन गतिविधि के कैनेटीक्स एसएसएम और proteoliposomes या झिल्ली टुकड़े के बीच capacitive युग्मन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है. विधि, इसलिए, केवल transien पैदावारटी धाराओं. मौजूदा शिखर स्थिर परिवहन गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. समय निर्भर ट्रांसपोर्टर धाराओं सर्किट विश्लेषण से खंगाला जा सकता है. इस पद्धति का विशेष रूप से पैच दबाना या वोल्टेज दबाना तरीकों से जांच नहीं की जा सकती जो intracellular झिल्ली, से प्रोकार्योटिक ट्रांसपोर्टरों या यूकेरियोटिक ट्रांसपोर्टरों के लिए अनुकूल है.

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Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

यहाँ हम electrogenic झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए उसके आवेदन पर ध्यान देने के साथ ठोस समर्थित झिल्ली पर आधारित एक electrophysiological तरीका मौजूद है.

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