Name: introduction to solid supported membrane based electrophysiology
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Мы благодарим J. Garcia-Celma, я Смирнова и Р. Kaback за вклад в кружевных измерений и E. Бамберг за поддержку и полезные обсуждения.

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

1. Преимущества SSM основе электрофизиологических сравнению с традиционными методами SSM основе электрофизиологии зарекомендовал себя как ценный инструмент электрофизиологических инструментов. Это особенно полезно в тех случаях, когда соглашение электрофизиологии, а именно зажим патч и способы фиксации потенциала, не могут быть применены: Помимо редким исключением бактериальных транспортеров не могут быть исследованы с помощью фиксации потенциала или методов патч зажим из-за малого размера бактерий и потому их трудно выразить в клетках млекопитающих или ооцитов. Но и физиологически значимых млекопитающих транспортеры могут быть исследованы. В этом случае на основе SSM электрофизиологии является привлекательным для перевозчиков из внутриклеточных мембран и для скрининга приложений в лекарственных препаратах из-за своей надежности и ее потенциал для автоматизации. ССМ-basedUsing обычных электрофизиологии, с разрешением по времени характеристику транспorters является сложной задачей. Поскольку оборот транспортеры низка гигантские патч &quot;или конфигурации&quot; целая клетка &quot;требуется, имеющих по своей сути низким временным разрешением в эксперименте по обмену решение. Осложнения могут быть преодолены использованием фотолитическим релизе подложке. Однако, только ограниченное количество подложки подходит для этого подхода. Здесь быстрый обмен раствора при SSM предлагает уникальную возможность для выполнения электрофизиологических исследований с высоким разрешением по времени использования произвольных подложках. 2. Ограничения и важных шагов В отличие от зажима патч и методики фиксации потенциала, SSM основе электрофизиологических не может быть использован для применения потенциала. Transporter характеристику поэтому ограничивается видами транспорта, которые не полагаются на мембранный потенциал. В общем, SSM основе электрофизиологических не имеет ограничений относительно типа (электрогенных) транспортера. Но КЛМетоды усилителя или патч зажим может иметь преимущества, если внутриклеточных компонентов, таких как белки, необходимые для белка функциональности. Ограничения могут возникнуть, если решение обмена создает большие токи артефакт. Это происходит, когда подложка сильно взаимодействует с SSM, как в случае липофильных соединений. Артефакт управления может быть использован для корректировки измеренных сигналов. Кроме того высоким содержанием соли фона во всех измерений буферы могут быть использованы для уменьшения артефактов. Однако в тех случаях, когда размер артефакт сопоставима с белком сигнал, это почти невозможно выделить белок связанный сигнал от артефакта. К счастью, высокий артефакты необычны в оптимизированным решением. Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для успешной реализации ССМ-эксперимента на основе электрофизиологии. Подготовка образца белка является наиболее важной частью. Если протеолипосомами используются, убедитесь, что реконовпроституцией способ дает чистое, воспроизводимый образец достаточного LPR и транспортер ориентирована в правильном пути. LPR может быть проверена путем сублимационной перелома электронной микроскопии и ориентации эксперименте ELISA если антитела имеются. Используйте только SSM, который показывает оптимальные параметры для инкубации образца белка. Инъекций белка еще один важный шаг. Обработка ультразвуком имеет важное значение и пузырьки воздуха следует избегать во время инъекции. После инкубирования пробы измерений сама критическая, потому что пузырьки воздуха удалит адсорбированная образец белка от датчика чипа. Поэтому всегда удаления пузырьков воздуха после изменения решения. Тем не менее сигнал изложение может произойти. Для устранения возможного изложение сигнала, очень важно, чтобы выполнить изложение управления в ходе эксперимента. 3. Специализированные системы SSM-установки могут быть изменены в соответствии с применением. Кроме того тЗдесь совершенно разные, узкоспециализированные Доступны типы установок. Существует возможность измерения белка сигналы при асимметричных условиях, например, под градиент рН. Чтобы установить асимметричные композиции буфера внутри и снаружи протеолипосомами третье решение, отдыхая решение, должен быть введен, и это требует двойной конфигурации обмена. Здесь дополнительно трехходовой клапан переключения между не-активирующих и покоя решений не требуется. Для увеличения времени разрешение системы мы разработали альтернативный путь потока отсутствует терминал клапан, но с использованием другого типа кюветы. Здесь стыке активирующих и не-активирующий раствор расположен внутри кюветы, 3 мм в передней части защитного механизма. Эта установка хорошо подходит для кинетического анализа быстропротекающих процессов транспорта. Это может быть показано, что временное разрешение по цене от 2 мс возможна. Коммерческая FUlly автоматизированным системам направленных на значительно более высокой пропускной способности для скрининга лекарственных средств. Подвижное устройство собирает решений и вводит их на поверхности сенсора в 96-луночных планшетах в стандартном формате микротитрационных плашек.

Здесь мы показываем новые электрофизиологические подход, основанный на твердом носителе мембраны (SSM) для характеристики электрогенных мембранных белков. Твердый носитель состоит из тонкого слоя золота на предметное стекло, датчик чипа. Гидрофильные поверхности золота используется для связывания тиоловой группой alcanethiol реагента. После этого selfassembly из фосфатидилхолина monolyer завершает формирование защитного механизма. Для измерения электрогенных реакции мембранных белков, протеолипосомами или фрагменты мембран, адсорбируются SSM (рис. 1). Белок, содержащий мембрану и ССМ затем образует емкостной связью мембранной системы. Таким образом, заряд транслокации в белок, содержащий мембраны могут быть обнаружены посредством емкостной связи через SSM. Этот метод дает лишь переходные токи. Пиковый ток представляет стационарных транспортной деятельности. Зависит от времени Cu Transporterrrents может быть восстановлено путем анализа схем. Сенсорный чип смонтирован в систему кюветы (рис. 2). Кювета имеет цилиндрическую кювету объемом 17 мкл (нетто-объем с уплотнительным кольцом установлен). Контактный пружинного контакта создает контакт с усилителем. Выпускной патрубок ввинчивается в верхнюю часть основной части и несет опорный электрод, хлорированный серебряная проволока. Кюветы устанавливают в клетку Фарадея. Это связано потока текучей среды, который используется, чтобы вызвать транспортный активность мембранного белка в ответ на быстрый обмен раствор (фиг.3). В одном решении протокол обмена два решения, одно не-активирующих и один активизирующий раствор, обязательны для заполнения. Поток контролируется сжатым воздухом с помощью программного обеспечения управления клапаном на компьютере или Выключатели на интерфейсный блок.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

Электрофизиологические методы приведены основана на твердом носителе мембраны (SSM), состоящий из octadecanethiol хемосорбированный слой на золотом покрытием сенсорного чипа и фосфатидилхолин монослой на вершине. Этот блок установлен в системе кювету с электродом сравнения, хлорированный серебряная проволока. После адсорбции в мембранных фрагментов или протеолипосом содержащий мембранный белок, быстрый обмен решение используется, чтобы вызвать транспортный активность мембранного белка. В одном решении протокол обмена два решения, одно не-активирующих и один активизирующий раствор, необходимы. Поток контролируется сжатого воздуха и клапан и трубопровод системы в клетке Фарадея. Кинетика электрогенных транспортной деятельности получается с помощью емкостной связи между SSM и протеолипосомами или мембранных фрагментов. Способ, таким образом, дает лишь transienT токов. Пиковый ток представляет стационарных транспортной деятельности. Зависит от времени токи транспортера может быть восстановлена ​​схема анализа. Этот способ особенно подходит для прокариотической или эукариотической транспортеры транспортеры из внутриклеточных мембран, которые не могут быть исследованы зажим патч или напряжение методы зажима.

До сих пор SSM основе электрофизиологических был использован для характеристики более 20 транспортеров, в основном, из прокариотических происхождения, например Melb 3, 4 и NhaA PutP 5 (сведены в 6). Но и эукариотических транспортеры из внутриклеточных мембран, например ClC7 7, а также ионные каналы, например, никотиновые рецепторы ацетилхолина 8 были исследованы. Здесь мы приводим в качестве примера измерения сахара / H +-котранспортера Лейси из кишечной палочки протеолипосом с использованием по меньшей мере 85% правую сторону ориентированных Лейси в LPR из 5 9, 10. Мы ориентируемся на основные шаги, ведущие к минимальной кинетической модели этого транспортного белка. 1. Электрофизиологические характеристики дикого типа кружевные Первый шаг заключается в общей характеристике электрогенных реакции путем измерения различных значениях рН ( <strong<html> &gt; Рисунок 4), концентраций субстрата (рис. 5) и субстратов. Для проверки техники, K M и ПК значений, приведенных в литературе были воспроизведены. РН зависимость кружевные показаны два разных электрогенных реакций. Емкостной ток увеличивается при рН 5 и рН 8,5, но и изменяет свою форму. В щелочных условиях устойчивой транспортной состояние наблюдается, а для кислых значениях рН только быстрые реакции электрогенных остается. Чтобы отличить устойчивые сигналы от быстрых реакций электрогенных мы использовали схему анализа реконструировать Transporter токов (рис. 6). При рН 7 монофазный двухфазный сигнал становится. Это также означает, что существует два различных электрогенных реакции. Оценка из перечисленных заряд (интеграл сигналов), две реакции около 6% и 94% от общей electrogenicity транспортного цикла. ove_step &quot;&gt; 2. Назначение электрогенных реакций Чтобы назначить двух электрогенных реакции на конкретные шаги в реакции цикла кружевной, кружевной E325A вариант измеряли (рис. 7). Этот вариант показывает только лактоза обмена, но недостаточна для всех активных видов транспорта, из-за ингибирование протонного выпуска. Сигнал E325A кружевные представляет быстрые переходные и является постоянной для всех измеренных значений рН. Формы и амплитуды сигнала похож на сигнал дикого типа Лейси в кислых условиях. Кроме того, мы наблюдаем небольшую отрицательную фазу после снижения пикового тока, что характерно для быстрых переходных токов, измеренных в емкостной связью систем. Потому лактозы связывание и высвобождение не электрогенных, быстрые переходные должны коррелировать с электрогенных конформационного перехода после лактозы обязательными. Известно, что протон шаг релиз скорости Limitiнг для кружевных оборот в лактозе градиента концентрации управляемой транспорта. В этом случае мы ожидаем, что увеличение скорости транспорта с щелочной рН, так как протон релиз благоприятствования. Это тот случай, для устойчивого состояния транспортных коррелирует сигнал дикого типа Лейси. Кроме того, он может быть показано измерения рН градиент, который только внутренний рН влияет на устойчивое транспортное состояние Лейси (не опубликовано). Поэтому большой электрогенных реакции могут быть отнесены к протону шаг выпуска. 3. Измерения для кинетического анализа После идентификации электрогенных реакций и выключать транспортных тарифов были определены с использованием SSM установка с высоким временным разрешением около 4,5 мс. Это возможно только в условиях, когда доминирует одна реакция сигнала. В этом случае константы скорости могут быть получены из переходных токов при рассмотрении разрешение по времени сигналов с использованием итеративного наименьших квадратов де<html> Алгоритм свертки (рис. 8). Определены константы скорости, а также предложенный минимальный кинетической модели (рис. 9), наконец, были использованы для моделирования кинетики Transporter. Моделируется воспроизводят изгибы SSM данные, которые дополнительно доказывает кинетической модели. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Рисунок 1. Адсорбция геометрии протеолипосом на ССМ. SSM формируется на сенсорный чип, структурированный золото покрытием предметное стекло. Для измерения электрогенных реакции мембранных белков, протеолипосомы или мембранные фрагменты адсорбированы на ССМ. Две мембраны образуют емкостной связью системы. Вот почему только переходных токов обнаружены. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Рисунок 2. SSM кювета несет чип датчика и электрода сравнения. Сенсорный чип зажат между кюветы и кюветы головы. Электрод сравнения изолирован от потока на пути солевого мостика полиакриламидном геле. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Рисунок 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Рисунок 3. Жидкость пути и электрическая схема SSM Setup. В единый протокол обмена решение только одного не активирующие (NA) и один активирующий (A) решения обязательны для заполнения. Поток контролируется двумя 2-ходовой клапан (V1) и один терминал клапана (V2). Терминал клапан переключался между неправительственными организациями и активирующие активирующих решения, направленные одним из решений в кювету и другие решения, чтобы контейнер для отходов (W). Сенсорный чип (SSM) подключен к усилителю (I / U)<html> в то время как эталонный электрод (AgCl) соединен с функционального генератора (F) во внешней электрической цепи. Компьютер (ПК) и интерфейсный блок используется для работы клапана и сбора данных. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Рисунок 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Рисунок 4. Переходных токов, измеряемых с диким типом Лейси протеолипосом после 100 мМ концентрации лактозы скачков при различных значениях рН. Не-активирующий раствор содержал 100 мМ глюкозы, в то время как активирующий раствор содержал 100 мМ лактозы. Все растворы готовили в 100 мМ калий-фосфатном буфере при указанном рН с помощью 1 мМ DTT. Подробности условий измерений в этом и следующих рисунках пожалуйста, обратитесь к 9 и 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Рисунок 5. Средняя нормированная Пик токов, измеряемых с диким типом Лейси протеолипосом после лактоза скачков концентрации при различных концентрациях и рН. К М значений, полученных из гиперболической подходит. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Рисунок 6" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> Рисунок 6. Реконструкция транспортер токов. Переходных токов (А) используется для восстановления транспортер тока (B) были измерены с диким типом Лейси протеолипосом после 100 мМ концентрации лактозы скачков при рН 8,5 (голубой луч) и рН 5,2 (красная линия). При рН 8,5 непрерывного оборота наблюдается в то время как при рН 5,2 быстрый электрогенных реакция. Это отчетливо наблюдалась в реконструированном тока (B). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;Alt =&quot; Рисунок 7 &quot;FO: Content-ширина =&quot; 4 дюйма &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Рисунок 7. Переходный ток измеряется E325A кружевные протеолипосомами после 100 мМ лактозы скачок концентрации при рН 5,2. Этот кружевной вариант запрещен в протонной шаг выпуске транспортных цикла и поэтому транспортная-дефицитной. Небольшой отрицательный компонент наблюдалось характерное для быстрых переходных токов, измеряемых в емкостной связью системы и вызвано разряда мембраны емкость после быстрого электрогенных реакции. Его постоянная времени π0 определяется емкость и проводимость системы (рис. 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Рисунок 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Рисунок 8. Переходных токов, измеренных с диким типом кружевные протеолипосомами AFTEг различных скачков концентрации лактозы при рН 5,2. В этих условиях нет устойчивой транспортной состояние наблюдается, но электрогенных конформационного перехода на лактозу обязательными. Пунктирная линия показывает передаточную функцию представляющий разрешение по времени системы. На вставке показана определения и выключать константы скорости по наблюдаемой скорости постоянной Kobs с гиперболической подходят к данным. Наблюдаемое постоянной скоростью определяли по переходных токов с итерационным методом наименьших квадратов деконволюцией алгоритма 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Рисунок 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> Рисунок 9. Кинетическая модель реакции цикла Лейси. Две электрогенных шаги могут быть идентифицированы и охарактеризованы по SSM измерений. Сильно электрогенных реакции представляющий ~ 94% от общего смещения заряда в реакциицикла наблюдается только при нейтральных и щелочных значениях рН. Это могут быть отнесены к протона шаг релиз (синяя стрелка). Слабо электрогенных шаг наблюдается при кислых значениях рН, когда непрерывный оборот дикого типа Лейси ингибируется. Мы назначенный этой реакции электрогенных конформационного перехода на лактоза связывания, которое представляет 6% от общей перемещение заряда в реакционном цикле.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Здесь мы представляем электрофизиологических метод, основанный на твердом носителе мембран с акцентом на ее приложений для характеристики электрогенных транспортеры мембраны.

Введение в твердом носителе мембранный электрофизиологии

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Применение Microfluidics к электрофизиологии

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Изучение мембранных биогенеза с люциферазы основе Пробирной Гена Репортер

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Spinal Cord Electrophysiology

Спинной мозг электрофизиологии

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Введение в Worm Лабораторная работа: от культивирования червей для мутагенеза

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Клеточная L-глутатион Защита Анализы по изучению эндоцитоза и утилизации белков плазматической мембраны

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...