Name: improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens
Uploaded: 2013-01-06T14:00:00
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我々はこのプロジェクトのさまざまな段階でのヘルプ·アドバイス·クリティカルな入力を提供したすべての仲間たちに感謝したいと思います。このビデオ物品の生産はIMIDIA（からの資金でサポートされていました<a href="http://www.imidia.org" target="_blank">http://www.imidia.org</a> ）、教育と研究のためのドイツ語省（BMBF）は糖尿病研究（DZD、のためのドイツ語センターへ<a href="http://www.dzd-ev.de" target="_blank">http://www.dzd -ev.de</a> ）技術ドレスデン大学の大学病院カール·グスタフ·カールス。本書につながる仕事は助成合意N°155005（IMIDIA）、欧州連合（EU）の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）とEFPIAから財政的な貢献で構成されているそのうちの資源の下で革新的な医薬品·イニシアティブの共同事業からの支援を受けている企業の現物出資インチ

1。ヒト膵臓組織の凍結<ol><li>メスとピンセットで脂肪組織、血管、神経、非実質組織を削除し、ピース（〜0.5〜1センチメートルキューブ）に膵組織を切断。 </li><li> Cryomoldの中央に1膵組織片を置き、冷たいティッシュテックOCTコンパウンドで完全にそれをカバーしています。その底液体窒素で予め冷却2 - メチルブタンとスナップ凍結で覆われている瓶にCryomoldを置く。 -80℃で凍結したサ?...

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	<li>Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+single+cells+from+complex+tissues.">Laser capture microdissection of single cells from complex tissues.</a> Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).</li><li>Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>B&#246;tticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Gr&#252;tzmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Islets+from+Partially+Pancreatectomized+Patients.">Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients.</a> J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).</li><li>Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+human+pancreatic+beta-cells+and+RNA+preparation+for+gene+expression+profiling.">Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).</li><li>Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+human+islets+to+isolation+stress+and+the+effect+of+antioxidant+treatment.">Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment.</a> Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).</li><li>Abdelli, S., Ansite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+stress+signaling+pathways+activated+during+human+islet+preparation+and+following+acute+cytokine+exposure.">Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure.</a> Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).</li><li>Negi, S., Jetha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+beta-cell+gene+expression+reveals+inflammatory+signaling+and+evidence+of+dedifferentiation+following+human+islet+isolation+and+culture.">Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture.</a> PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).</li></ol>

我々は外科膵臓検体からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクション（LMD）のための信頼できるアプローチについて説明します。 LMD顕微鏡が利用可能な場合、この手順は、これにより、両方の非糖尿病と2型糖尿病患者からのヒト膵島材料へのアクセスを増加させる、部分的pancreatectomiesを実行する任意の研究機関で実施されることができる。これは、膵島単離のために提供膵臓の不足与えら?...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 2 - メチルブタン（イソペンタン） </td><td> ROTH </td><td> 3927.1 </td><td></td></tr><tr><td> AdhesiveCap（不透明、500μL） </td><td>ツァイス</td><td> 415190-9201-000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellstarチューブ（50ml）を</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 210 261 </td><td>サポートスカート</td></tr><tr><td> Cellstarチューブ（50ml）を</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 227.261 </td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート（DEPC） </td><td> SIGMA </td><td> D 5758 </td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td> VWR </td><td> 20821.310 </td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>絵筆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PALMマイクロビーム</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピールウェイの埋め込み型（切り捨て）、12×12ミリメートル</td><td> ProSciTech </td><td> RR12 </td><td>トップ内部22x22のミリメートル、奥行き21ミリメートル</td></tr><tr><td>アルクトゥルスPicoPure冷凍RNA単離キット</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td>キット0204 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製のクランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>かみそり</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNaseフリーのDNaseセット</td><td>キアゲン</td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseZAP </td><td> SIGMA </td><td> R 2020 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペル/外科用ブレード</td><td>テクノカット</td><td> 2800111 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrostプラス接着顕微鏡スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> J1800AMN​​Z </td><td> 25x75x1.0ミリメートル</td></tr><tr><td>組織 - Tek社のOCTコンパウンド</td><td>桜</td><td> 4583または0807000022 </td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td> BRAUN </td><td> BD168R </td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td> VWR </td><td> 28975.291 </td><td></td></tr></table>

improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens

レーザーマイクロダイセクション（LMD）は実質1,2分の金額から選択した細胞や組織の回復を可能にする技術です。解剖した細胞は、トランスクリプトームやプロテオーム研究は、DNAや染色体分析評価2,3として調査、種々の用途に使用することができます。 LMDの特に困難なアプリケーションは、RNA 4の不安定性に起因して、細胞は、膵臓などのRNaseの豊富な組織から解剖される場合に特に顕著であることができ、トランスクリプトーム解析、です。標的細胞の迅速な識別と収集を可能に顕微解剖プロトコルは組織の処理時間を短くすると、その結果、RNAの保全性を確保するためには、この設定には不可欠です。 ここでは、トランスクリプトーム研究5に使用する手術標本からヒト膵β細胞を取得するためのプロトコルを記述します。約0.5〜cの膵臓の小片m 3をティッシュテックOCTコンパウンド、直ちに2 -メチルブタンチルドで凍結し、-80℃で保存しセクショニングまで、Cに埋め込 ​​ま摘出膵臓標本の健康現れるマージン、から切り出した。 10μmの厚さの四連続切片1〜2分間クライオスタット内部に乾燥したガラススライドに個別に転送-20℃設定、、、下のクライオスタットでカットし、-80℃で保存した直ちにレーザーマイクロダイセクションの手順の前に、切片を氷冷100％の2つの1分インキュベーションすることにより、氷の寒さの中に固定されたばかりの30秒間、70％エタノールを調製し、氷冷DEPC処理水で5月6日ディップで洗浄し、脱水したエタノールは4分間キシレン（組織の脱水に使用される）に続いて、組織切片を3〜5分間、その後、風乾した。重要なことは、すべての手順は、キシレン中でのインキュベーションを除いて、氷のように冷たいの試薬 ​​を用いて行った-以前に記述されたプロトコル6以上修正。 UT氷冷試薬のilizationは、ベータ細胞の内因自家蛍光の顕著な増加をもたらした、との認識を容易にした。顕微解剖のために、4つのセクションでは、各時間脱水した：2、ホイル·ラップに入れた50 mlチューブ、湿気や漂白から組織を保護するために、残りの2は直ちに顕微解剖された。この手順は、（AutoLPC）モードに突入させた自動レーザ圧接を採用PALMマイクロビーム装置（Zeiss）を用いて行った。 40-60分よりもはや不要4凍結切片からベータ細胞/小島清の完成。細胞は1 AdhesiveCapに集め、10μlの溶解緩衝液で溶解した。トランスクリプトーム解析のために、それぞれの単一のRNA試料がピコ純粋なRNA単離キット（アルクトゥルス）を用いてRNAを抽出し、10セル顕微サンプルを結合することにより得た。このプロトコルは、このように彼らの迅速かつ正確な認識とcを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を改善ollection。この手順のさらなる改善は、2型糖尿病に伴う変化を理解するためのより良い可能性のある影響で、表現型が異なるβ細胞の解剖を可能にするかもしれません。

図1に示すように、修正された脱水プロトコルは、以前公表されたプロトコール6に比べてβ細胞の自家蛍光の改善につながった。記述されたプロトコルを適用すると、39外科膵臓標本のそれぞれが31&#39;544&#39;704μmの3組織/膵臓標本（： - 81&#39;522&#39;153μmの3 8&#39;742&#39;390範囲）の平均のための40のシリアル凍結切片を生成するために使用された表1</strong...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Collection Protocol for Human Pancreas

ヒト膵臓の収集プロトコル

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

ヒト膵島の染色プロトコル

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

肝動脈再建を用いた部分同所性肝移植のラットモデルのための外科的処置

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

臨床関連動物モデルおよび3D免疫化学における使用のための外科検体からのハイグレード神経膠腫細胞培養の最適化

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

レーザーのドップラー: 膵微小血管皮膚血管運動In Vivo測定のためのツール

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...