Name: a murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis
Uploaded: 2013-05-14T12:00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis at JoVE.com

Ringraziamo la signora Angela Freund per l&#39;eccellente assistenza tecnica nel sezionare gli stent incorporati in plastica. Ringraziamo anche la signora Roya Soltan e la signora Angela Freund per l&#39;aiuto professionale con la colorazione immunoistochimica.

1. Preparazione ed impianto di stent <ol><li> Lo stent-puntoni (Fort Wayne Metalli, Castlebar, Irlanda) sono stati intrecciati e poi tagliare alla misura desiderata, presso l&#39;Istituto per la Tecnologia Tessile e Ingegneria Meccanica, RWTH Aachen University, in Germania (Figura 1A). </li><li> Prima dell&#39;impianto, gli stent devono essere trasferite in un tubo 2 cm silicio, usando pinze, e disposto 2 mm ad una estremità terminale, cui estremità anteriore (Figura 1A). </li><li> L&#39;estremità anteriore deve essere tagliato obliquamente, per garantire una punta tagliente per l&#39;impianto. </li><li> Prima dell&#39;impianto, lo stent dovrebbe essere abbondantemente innaffiato, per assicurare lo slittamento. </li></ol> 2. Impianto di stent <ol><li> 10-12 settimane maschio C57BL / 6 topi di tipo selvatico, 25-27 g sono anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xilazina. Anesthetization corretta è confermato prima dell&#39;intervento dalla mancanza di riflessi emovimento barba. Per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia, gli occhi mouse sono coperti da una pellicola di bepanthene crema. </li><li> Dopo rasatura e corretta disinfezione della zona del collo ventrale, una piccola incisione mediana di 1 cm è eseguita sotto uno stereomicroscopio, usando le forbici. Dopo separazione delle due corpi grassi con sterili pinze curve, l&#39;arteria carotide comune sinistra può essere visto pulsare insieme alla trachea. </li><li> 1 cm dalla carotide comune sinistra e la biforcazione devono essere liberi preparati. 1 nodo con un filo 5/0 seta sarà legato intorno all&#39;arteria carotide comune di sinistra, due nodi utilizzando 7/0 fili di seta saranno vincolati intorno all&#39;arteria carotide esterna sinistra, e 1 nodo utilizzando un filo di 7/0 seta saranno vincolati intorno l&#39;arteria carotide interna (Figura 1B). </li><li> Il flusso di sangue viene poi interrotto legandosi ai nodi sulla carotide interna e la carotide esterna prossimale saldamente, nonché tirando il nodo circondanozione della carotide comune. Il recipiente deve essere fissato in modo che l&#39;arteria carotide comune ed esterna sono in linea retta. </li><li> Una piccola incisione alla carotide esterna viene eseguita, in prossimità del nodo prossimale, usando una forbice Vannas. Il tubo di silicone contenente lo stent viene introdotto nella carotide esterna, con la punta davanti, utilizzando una guida-filo. Dopo lo stent raggiunge la posizione desiderata, il tubo di silicone è tirato indietro oltre il guida-filo e consente l&#39;espansione a memoria di forma dello stent (Figura 1B). </li><li> Il nodo distale sulla carotide esterna si legano strettamente a chiudere il sito di incisione e di nodi a livello dell&#39;arteria carotide interna e comune vengono rimossi, ripristinando così il flusso di sangue. </li><li> L&#39;incisione cutanea viene chiusa utilizzando 3-4 Michel clip di sutura e un Michel forcep. Il mouse è posto sotto la luce rossa fino al pieno recupero. Un trattamento analgesico non è necessario. </li><li> Gliplacca può essere analizzato dopo 1-3 settimane. Per studiare la ri-endotelizzazione, un punto finale-tempo precedente è necessario (3-4 giorni). Abbiamo osservato nel nostro modello di impianto dello stent che 4 settimane dopo questo intervento chirurgico, in particolare mediante l&#39;uso di rivestimenti specifici biofunctionalize gli stent miniaturizzati, neoangiogenesi verifica in circa il 30% del campione. Questa è una cerva per i processi di rimodellamento e rigenerativa, con diversi meccanismi e che rappresentano un altro problema patologico. Per concentrarsi sulla formazione di neointima, stenosi in-stent e / o di analisi dei meccanismi alla base di questi effetti collaterali dopo l&#39;impianto dello stent un punto di 3 settimane del tempo della fine sarebbe utile non confondere con gli effetti rigenerativi indotti dall&#39;insorgenza di neoangiogenesi. </li></ol> 3. Analisi della placca Formazione <ol><li> Nel punto finale del tempo, gli animali sono anestetizzati utilizzando iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xilazina.Anesthetization corretta è confermato prima dell&#39;intervento dalla mancanza di riflessi e movimento barba. </li><li> Gli animali vengono uccisi per dissanguamento intracardial. Il siero di sangue viene raccolto per ulteriori analisi. </li><li> Dopo l&#39;apertura della cavità toracica e PBS lavaggio attraverso intracardial puntura, un corpo-perfusione con soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) è effettuata per 5 min. L&#39;arteria carotide sinistra contenente lo stent è sezionato, direttamente posto in una soluzione al 4% PFA e almeno 16 ore dopo embbeded in plastica. </li><li> 50 sezioni spesse micron vengono eseguite su campioni di plastica-embedded che utilizzano una banda diamantato. </li><li> Per misurare la dimensione della placca, viene eseguita Giemsa. </li><li> Per analizzare il tasso di ri-endotelizzazione all&#39;interno dell&#39;area stent del vaso, viene eseguita immunoistochimica per fattore di von Willebrand (vWF). </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per ridurre il rischio di trombosi in-stent e ristenosi e di sostenere lo sviluppo di nuovi rivestimenti per gli stent a rilascio di farmaco, un modo facile, metodo semplice e accessibile di impianto di stent in un modello animale è necessario. Topi consegnare il sistema ideale per studiare i complessi meccanismi di rimodellamento arterioso dopo l&#39;impianto dello stent e l&#39;efficienza di tali farmaci. Modelli esistenti per la ristenosi in-stent nel topo sono difficili, richiedono elevate competenze chirurgiche e implicano elevati rischi di complicanze come sanguinamento o paralisi 17-19. Per esempio, nel modello di stent-impianto in aorta toracica di un topo donatore dopo palloncino-dilatazione del vaso e poi trapianto del segmento di stent in arteria carotide di un topo 17 destinatario, lo studio dei patogeni-meccanismi non è influenzato solo dalla reazione destinatario di materiale donatore, ma anche dalla massiccia dannosa dei vasa vasorum e avventizia. L&#39;impianto di una stee inossidabilel stent direttamente in aorta addominale dopo palloncino dilatazione-19 è seguito da un alto tasso di mortalità (35%) a causa della paralisi zampa posteriore dopo trombosi o sanguinamento dall&#39;aorta addominale sul sito di arteriotomia. Impianto di una spirale autoespandibile in nitinol stent-in aorta addominale attraverso l&#39;arteria femorale 18 necessita elevate competenze chirurgiche, soprattutto a causa ciecamente dirigere lo stent lungo la ramificazione dal arteria femorale per aorta per posizionare lo stent nella posizione giusta. Questa procedura è seguita da un elevato rischio di danneggiare il nervo femorale, quindi paralisi del posteriore. Rispetto a queste procedure, il nostro modello di impianto di stent nel topo non ha bisogno di elevate competenze chirurgiche. Il nostro modello offre un metodo semplice, facile ed efficace per analizzare gli effetti di diversi farmaci-rivestimenti su rimodellamento arterioso, l&#39;immissione dello stent è realizzato sotto la vista, e non ci sono rischi di danneggiare i nervi o altre strutture. Il commeccanismi molecolari complessi possono essere studiati più facile nel nostro modello di topo stenting dell&#39;arteria carotide, non solo per l&#39;accessibilità diretta della nave, ma anche a causa della presenza di diversi topi knock-out ceppi. Come una limitazione, a confronto con la procedura clinica, il nostro modello utilizza i topi / arterie sane e non esegue stenting su targhe preesistenti (non ristenosi in-stent, ma stenosi in-stent). Anche noi non eseguiamo palloncino dilatazione prima di stent-impianto. Tuttavia, a causa dei danni massiccia della parete del vaso in entrambi i modelli, i processi riparativi sono simili. Sfortunatamente, a causa dei manufatti metallo-derivati, un monitoraggio in vivo della crescita neointimale non è possibile mediante metodi di imaging esistenti come ecografia o tomografia computer. Un altro fattore limitante è la sottile sezionamento di stent a base metallica, che richiede una certa esperienza nella lavorazione del metallo. Utilizzando questo metodo, siamo statiin grado di dimostrare, che neutrofili istruire biofunctionalized miniaturizzati nitinol stent ricoperti di LL-37 riduce in-stent restenosi, fornendo un nuovo concetto per promuovere la guarigione dopo terapia interventistica vascolare 21. Nonostante questi limiti, questo modello sembra essere, fino ad ora, il sistema più adatto, in tal modo denaro e risparmio di tempo, per studiare nuovi farmaci-rivestimenti per stent e dei loro effetti sugli eventi molecolari durante rimodellamento arterioso. Inoltre, questo modello può essere facilmente adattato al criceto, che è più simile a quella umana, in modo che ogni ipotesi terapeutica può essere verificata prima di applicare a grandi animali o umane per evitare effetti spiacevoli e inaspettati.

Le malattie cardiovascolari causate dalla progressione dell&#39;aterosclerosi sono la principale causa di morte nei paesi industrializzati. L&#39;aterosclerosi è una focale, fibro-infiammatorio risposta proliferativa della parete vascolare al danno endoteliale 1, causando la formazione di una placca estesa nel lume del vaso, che colpisce il flusso sanguigno attraverso le arterie coronariche. Oltre il 75% di infarti del miocardio risultato dalla rottura del cappuccio fibroso sottile del 2 placca infiammata. Dal momento che questa complicanza può essere fatale, un percutanea transluminale (coronarica) angioplastica (PTCA) con impianto di stent è diventata la terapia di prima scelta nella pratica medica corrente. Il metodo consente la dilatazione dell&#39;arteria coronaria ristretta e quindi il ripristino del flusso sanguigno. Contemporaneamente, provoca una lesione misura all&#39;endotelio e vaso parete 3. Tuttavia, l&#39;effetto a lungo termine di questa terapia è limitato da un remode arterioso eccessivoling e restenosi 4. Da impiego di stent, la PTCA divenne più efficace nel trattamento delle lesioni complicate, permettendo rivascolarizzazione dopo una chiusura acuta del vaso 5. Questo metodo riduce l&#39;incidenza di restenosi intrastent a meno del 10% 6. Accanto a questi vantaggi, la terapia di prima scelta per la rivascolarizzazione coronarica porta anche i rischi di pericolo di vita della trombosi in-stent e ristenosi. Trombosi in-stent è causata da una de-endotelializzazione della nave, seguita da una massiccia adesione delle piastrine e fibrina al sito feriti. 26% dei pazienti soffre di trombosi in-stent e 63% muore di infarto del miocardio 7. Restenosi si riferisce al processo di guarigione della ferita dopo la lesione meccanica alla parete del vaso, coinvolgendo iperplasia neointimale (migrazione e la proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), deposizione di matrice extracellulare (ECM), e rimodellamentodella nave. Spesso, un invasivo re-intervento diventa necessario dilatate vasi aterosclerotici gravemente socchiusi a causa di trombosi in-stent e ristenosi. Per prevenire la trombosi in-stent, un trattamento a lungo termine con farmaci anti-trombotici è necessaria 8. Per prevenire la restenosi, nuova generazione di stent medicati eluire agenti anti-proliferativi come i farmaci immunosoppressori (ad es sirolimus, everolimus, zotarolimus) e farmaci anti-tumorali (per esempio paclitaxel) da un rivestimento in polimeri per diversi mesi 9,10. Sebbene questi farmaci diminuiscono la formazione della neointima e restenosi, mantengono un elevato rischio di trombosi in-stent inibendo la ri-endotelizzazione. Dopo lesione arteriosa, il mantenimento del vano endoteliale è essenziale per evitare complicazioni trombotiche. In condizioni fisiologiche, l&#39;endotelio umano mostra un piccolo indice di rotazione 11. Sotto Pathological condizioni, tuttavia, l&#39;integrità endoteliale è compromessa, in modo che un rapido recupero circondando cellule endoteliali mature circolanti e cellule progenitrici endoteliali (EPC) è richiesta 12,13. Lo studio di questi meccanismi molecolari complesse in animali più grandi o 14-16 in topo aortico arteria è una procedura molto difficile, offrendo dati limitati 17-19. Per verificare l&#39;efficacia di nuovi stent-rivestimenti per ridurre la trombosi in-stent e ristenosi nuovi modelli sono indispensabili. Nitinol rappresenta la piattaforma ideale per gli stent a causa della sua &#39;elevata elasticità, effetto di memoria di forma e buona tolleranza nei pazienti, essendo usato con successo come stent metallici in uso clinico. Questa lega ha permesso di creare uno stent miniaturizzato con diametro esterno di 500 micron, che possono essere rivestite 20 e impiantati nella carotide di topo. Lo sviluppo di un miniaturizzato nitinol stent per il mouse carotid arteria, permette lo studio dei meccanismi molecolari precisi indotta da impianto di stent e offre la possibilità di testare in modo rapido ed efficiente gli effetti dei diversi farmaci-rivestimenti per prevenire la restenosi. Inoltre, l&#39;esistenza di diversi topi knock-out ceppi rappresenta un enorme vantaggio per chiarire il ruolo delle diverse molecole coinvolte nella crescita neointima e la trombosi in-stent.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitinol-stents (self-made from nitinol-struts)</td>
			<td>Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 &mu;m</td>
			<td>custom-made product</td>
			<td>Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon tube</td>
			<td>IFK Isofluor, Germany</td>
			<td>custom-made product</td>
			<td>diameter 500 &mu;m, section thickness 100 &mu;m, polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 108000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide-wire</td>
			<td>Abbott Vascular</td>
			<td>1001782-HC</td>
			<td>0.014-inch angioplastie guide-wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel suture clips</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>BN507R</td>
			<td>7.5 x 1.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Forcep</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>BN730R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis

Nonostante i notevoli progressi compiuti nello sviluppo dello stent nel corso degli ultimi decenni, le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morte nei paesi occidentali. Oltre ai vantaggi offerti dallo sviluppo di diversi stent medicati, la rivascolarizzazione coronarica porta anche i rischi di pericolo di vita della trombosi in-stent e ristenosi. La ricerca sulle nuove strategie terapeutiche è compromessa dalla mancanza di metodi adeguati per studiare l&#39;impianto dello stent e di processi di restenosi. Qui, descriviamo una procedura rapida e accessibile di impianto di stent a topo carotide, che offre la possibilità di studiare in un modo conveniente i meccanismi molecolari della nave rimodellamento e gli effetti dei rivestimenti dei farmaci diversi.

<ol><li> L&#39;impianto di un miniaturizzato nitinol stent in arteria carotide sinistra di topi prende 25-30 min e mostra una mortalità del 10% principalmente a causa del danneggiamento del vaso durante l&#39;intervento. Una migliore tasso di sopravvivenza è osservata in topi aventi un peso superiore a 25 g al momento dell&#39;impianto dello stent (tasso di mortalità del 5%). Pertanto, abbiamo scelto per i topi di impianto con un peso tra 25-27 g. Dopo l&#39;intervento chirurgico, i topi recuperare da anestesia entro 2-5 min e senza menomazioni fisiche, come ad esempio la paralisi, si osservano. Micro-Computer Tomography (micro-CT), l&#39;imaging effettuato una settimana dopo l&#39;impianto dello stent ha dimostrato che gli stent non sono dislocati dal flusso di sangue (Figura 1C). Purtroppo, l&#39;analisi di neointima formazione in queste immagini non è possibile a causa delle manufatti metallo-derivati ​​(Figura 1D, 1E). </li><li> Non abbiamo osservato alcuna nave o danni endoteliali della zona unstented della nave, immediatamente sotto lo stent, Come rilevabile dal istologica (Figura 2A) e mediante colorazione specifica per endotelio (Figura 2B, anti-topo CD31 anticorpo). Per una migliore visione d&#39;insieme, la sezione è stata digitalizzata utilizzando un laser a due fotoni microscopia a scansione (Figura 2B, 2C). </li><li> Nel vaso stent, viene rilevata una dilatazione permanente del 15% (rapporto stent: arteria, 1,15:1) da topi con un peso tra 25-27 g. Formazione della neointima e trombo-formazione possono essere analizzati con colorazioni istologiche classiche (ad esempio ematossilina-eosina, Giemsa, Movat, blu di toluidina, Masson-Trichrom-Goldner, Figura 3A, 3B). Dal momento che la lamina externa e internazionali non sono più visibili, la dimensione della placca è stato calcolato come la differenza di esterni e le aree luminale (media dell&#39;area della placca: 234566 ± 3315 micron 2, intende un&#39;area luminale: 12036 ± 2662 micron 2). Circonferenza esterna è stata anche misurata (media: 1.799 ± 14 micron). Per l&#39;analisi dellacomposizione cellulare, le sezioni devono essere deplastified e colorati con marcatori specifici. Per la ri-endotelizzazione, abbiamo utilizzato un anticorpo anti-CD31 Cy3-coniugato e di proliferazione delle cellule muscolari lisce un FITC-coniugato anticorpo anti-SMA (Figura 3C). Re-endothelialization stata calcolata come percentuale del CD-31 macchiato positivo alla superficie luminale totale (media: 23,07 ± 3,14%), una settimana dopo l&#39;impianto dello stent. </li></ol> Naturalmente, un numero illimitato di colorazione specifica è possibile, secondo esperienza ogni laboratori &#39;. Analisi di miosina catena pesante, per una migliore caratterizzazione di SMC, ma anche l&#39;analisi di cellule infiltrate (monociti, linfociti), o per colorazioni differenti citochine infiammatorie può anche essere effettuata, a seconda della scopo dello studio. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig1highres.jpg" sr<html> c = &quot;/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Schema della procedura chirurgica (A). Il flusso di sangue viene interrotto legandosi ai nodi sulla carotide interna e la carotide esterna prossimale saldamente, nonché tirando il nodo che circonda l&#39;arteria carotide comune. Il tubo di silicone contenente lo stent viene introdotto nella carotide esterna attraverso una piccola incisione alla carotide esterna. Dopo lo stent raggiunge la posizione desiderata, il tubo di silicone è tirato indietro oltre il guida-filo e consente l&#39;espansione a memoria di forma dello stent. Immagini microtomografiche illustranti la posizione dello stent una settimana dopo l&#39;impianto chirurgico (B). A causa dei manufatti materiale-derivati, un&#39;analisi della crescita neointima non è possibile (C, D). 3fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Unstented superficie del vaso non è influenzato dalla procedura chirurgica, come dimostrato da blu di toluidina (A) e-specifici endoteliali CD31 colorazione (B, C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi della placca può essere eseguita da colorazioni istologiche classiche (es-Trichrom Masson-Goldner) (A). Il trombo organizzati possono essere rilevate da deposizioni fibrina nero impiallacciato all&#39;interno del neointima, in alcuni casi si osserva una completa occlusione del vaso (B). Re-endotelizzazione (Cy3, rosso) o la proliferazione delle cellule muscolari lisce (FITC, verde) è stato rilevato con un doppio immunofluorescenza utilizzando marcatori specifici.Di contrasto è stata eseguita con 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, blu) (C). Abbiamo notato un completato ri-endotelizzazione delle maglie dello stent (a sinistra, doppia freccia), a fronte di una incompiuta luminale ri-endotelizzazione (a destra, freccia singola).

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A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

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