Name: isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

In addition, we thank the cardiac surgeons at Heidelberg University for the provision of human atrial tissue and Claudia Liebetrau, Katrin Kupser and Ramona Nagel for their excellent technical support. Special thanks also to Andy W. Trafford for his helpful suggestions and advice during the establishment of the Ca2+ transient measurements. The authors wish to express their deepest gratitude to the members of the Department of Pharmacology and Toxicology (head: Ursula Ravens) of the Dresden University of Technology for the opportunity they offered us to learn basic techniques and skills in cellular electrophysiology and cardiomyocyte isolation.
The authors' research is supported by the German Research Foundation (Do769/1-1-3), the German Federal Ministry of Education and Research through the Atrial Fibrillation Competence Network (01Gi0204) and the German Centre for Cardiovascular Research, the European Union through the European Network for Translational Research in Atrial Fibrillation (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, large-scale integrating project, Proposal No. 261057) and the European-North American Atrial Fibrillation Research Alliance (ENAFRA) grant of Fondation Leducq (07CVD03).
The schematic overview shown in the video file was produced using Servier medical art.

تحتاج البروتوكولات التجريبية لتتم الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية وجميع المرضى الذين يحتاجون لإعطاء الموافقة المسبقة عن مكتوب. وقد وافق بحثنا من قبل لجنة أخلاقيات الطبية كلية مانهايم، جامعة هايدلبرغ (# 2011-216N-MA) وأجريت في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. أعطى جميع المرضى الموافقة المسبقة عن مكتوب. 0. الحصول على الأنسجة الأذيني الإنسان خلال الإجراءات الروتينية القسطرة لدى المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح لتجاوز القلب التطعيم، وعادة ما يتم إزالة غيض من احقة الأذين الأيمن، ويمكن استخدامها لعزل العضلية الأذيني. بعد الختان يتم نقل عينات الأنسجة على الفور في أنبوب 50 مل الصقر العقيمة مع كا 2 + خالية حل النقل التي تحتوي على 2،3-butanedione monoxime (الجدول الأول؛ BDM، المانع مقلص، ومنع خلية عضلية جontracture). مع أوقات النقل بين 30 و 45 دقيقة، لم نكن ندرك ميزة واضحة من التبريد أو الأوكسجين فيما يتعلق بكل من عدد ونوعية العضلية الأذيني المعزول. في وسائل النقل العامة إلى المختبر يجب أن تكون سريعة قدر الإمكان. ومع ذلك، إذا لا يمكن تجنبها وقتا أطول والنقل، والنقل في 4 درجات مئوية في حل الاوكسيجين قد يكون من المفيد. 1. Prearrangements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على thermocirculator، التي تسيطر على درجة حرارة الدورق تغلف (الجدول الثاني). تأكد من أن درجة الحرارة داخل الدورق يساوي 37 درجة مئوية. تغطية الكأس مع غطاء زجاجي للحفاظ على درجة حرارة ثابتة داخل الدورق في جميع مراحل عملية عزل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن كولاجيناز الأول والرابع والعشرون البروتياز إلى ثلاثة أكواب الزجاج وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. سوف تضعف الانزيمات فقط قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن 20 مل من كا 2 + حل الحرة في طبق بتري في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تخزين 250 مل من كا 2 + حل الحرة في حمام الماء عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. تنظيف الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات الأنسجة مع الحل النقل في طبق بتري (~ 10 سم القطر) وإزالة الأنسجة الدهنية تقريبا باستخدام مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن عينة الأنسجة. وتستخدم ما بين 200 و 600 ملغ لعزل الخلية. يمكن تجميد الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل لتحليل الكيمياء الحيوية في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات الأنسجة في طبق بتري تحتوي على 20 مل كا 2 + حل مجانية في 4 ° C (انظر الخطوة 1.3) وختم عينة الأنسجة إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم 3 في الحجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية عند 37 درجة مئوية وتحت بالغاز المستمر مع 100٪ O 2. غيض ماصة يمكن وضعها على أنبوب الأكسجين لتجنب محتدما قوية وتوليد تدفق الهواء المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع كا 2 + خالية حل فيإلى الدورق تغلف ويحرك المزيج بعناية لمدة 3 دقائق مع التحريك المغناطيسي بار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف اثارة والسماح للقطع الأنسجة ليستقر لبضع ثوان. توتر بعناية طاف من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني). إعادة قطع الأنسجة ضبط النفس من شبكة إلى الدورق باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة ملء كوب مع كا 2 + حل حرة وكرر الخطوة غسل 2.4 و 2.5 مرتين. </li></ol> 3. الهضم الأنزيمي الأول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق قطع الأنسجة مع 20 مل إنزيم حل E1 (الجدول الأول) التي تحتوي على كولاجيناز والبروتيني ويقلب بعناية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل للحصول على تركيز النهائي من 20 ميكرومتر كا 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 35 دقيقة سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) بطريقة أن معظم قطع الأنسجة البقاء في الدورق. عودة بقيةأمطرت قطع الأنسجة من شبكة إلى الدورق. </li></ol> 4. الهضم الأنزيمي الثاني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وقطع الأنسجة مرة أخرى مع 20 مل انزيم حل E2 تحتوي على كولاجيناز أنا فقط (الجدول الأول). إضافة 40 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل على الفور للحصول على تركيز النهائي من 20 ميكرومتر كا 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء استخدام مقص الهضم الثاني إلى مزيد من جلطات ختم الأنسجة في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5 دقائق أخذ عينة باستخدام ماصة باستور للتحقق من تفكك الخلايا. كرر هذا كل 2-3 دقائق حتى تظهر على شكل قضيب، العضلية المخططة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف اثارة والسماح للقطع الأنسجة ليستقر لمدة 20-30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) إلى 50 مل أنبوب فالكون (أنبوب). إعادة قطع الأنسجة ضبط النفس من شبكة إلى الدورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق قطع الأنسجة في الدورق مع 20 مل ستوراحل شركة جنرال الكتريك (الجدول الأول) 10 وكذلك فصل الخلايا عن طريق سحن الميكانيكية لطيف باستخدام ماصة المصلية 20 مل مع موزع. في محاولة لتجنب تشكيل فقاعة فقاعات منذ تضر بقاء الخلية والجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) في أنبوب 50 مل الصقر (أنبوب B). </li></ol> 5. الإعداد النهائي والنهائي من التعديل كا 2 + تركيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لكلا فالكون أنابيب ألف وباء (انظر الخطوة 4.5 و 4.7) في 95 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من كل من الأنابيب بعناية من قبل الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق كل من الكريات في 1.5 مل من محلول التخزين (الجدول الأول) كل (درجة حرارة الغرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مرتين 7.5 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 حل كل فالكون ويقلب بعناية. احتضان لمدة 10 دقيقة بعد كل خطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إضافة 15 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل النهائي للحصول على الكالسيوم 2 + تركيز 0.2 ملم. </li></ol> 6. التحميل من Myocytes مع كا نيون 2 + مؤشر فلوو-3 AM (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.5 مل من تعليق خلية (أنبوب A و / أو أنبوب B) في أنبوب microcentrifuge 2 مل (أنبوب إيبندورف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية في إطار النظر في الحساسية للضوء الفلورسنت من كا 2 + المؤشر فلوو-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 50 ميكروغرام من نفاذية الغشاء acetoxymethyl مشتقة استر من فلوو-3 (فلوو-3 صباحا، والجدول الثالث) في 44 ميكرولتر من بلورونيك F-127 (الجدول الثالث) حل سهم (20٪ W / V في DMSO اللامائية) للحصول على قطرها 1 مم فلوو-03:00 حل الأوراق المالية، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع على الأكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من فلوو-03:00 محلول المخزون إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 1.5 مل من تعليق خلية (انظر الخطوة 6.1) وتستنهض الهممبعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في مربع مبهمة بصريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في حوالي 6،000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من محلول حمام (الجدول الرابع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك تعليق خلية لمدة 30 دقيقة لإزالة الأسترة قبل البدء بالتجارب. </li></ol> 7. في وقت واحد التصحيح، المشبك وEpifluorescent كا 2 + قياسات منذ قياسات التصحيح، المشبك ليست هي الموضوع الرئيسي لهذا الاستعراض، ونحن إحالة القارئ المهتم إلى المنشورات الأخرى التي تقدم أكثر في وصف عمق هذه التقنية. 11-14 من اجل اكتمال نحن نقدم ملخصا موجزا لبروتوكول لقياس إمكانات العمل أو L-نوع كا 2 + التيارات، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا 2 تسجيلات +-عابرة. خلال التجارب التي superfused myocytes عند 37 درجة مئوية مع حمام solutiفي (الجدول الرابع) باستخدام نظام نضح السريع (Octaflow IITM، ALA الأدوات العلمية، NY). للتجارب الجهد المشبك، يتم حظر K + التيارات بإضافة 4 امينوبيرين (5 ملمول / لتر) وبووتون 2 (0.1 مليمول / لتر) إلى حل حمام. وتستخدم microelectrodes الزجاج البورسليكات وينبغي أن يكون التسديد على المقاومة من 2-5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة (الجدول V). بالإضافة إلى فلوو-3:00 التحميل من myocytes (راجع الخطوة 6)، يتم تضمين فلوو-3 أيضا في حل ماصة (الجدول V). هو متحمس مضان في 488 نانومتر والضوء المنبعث (&lt;520 نانومتر) تم تحويله إلى [كا 2 +] ط افتراض <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> حيث k د = ثابت التفكك لفلوو-3 (864 نM)، F = فلوو-3 مضان؛ F الحد الأقصى = كا 2 + مضان المشبعة التي تم الحصول عليها في نهاية كل تجربة 12 وتسجل كل الإشارات الكهربائية والكالسيوم 2 + إشارات epifluorescent في وقت واحد. يتم تحفيز إمكانات العمل عند 0.5 هرتز في الوضع الحالي، المشبك باستخدام 1 ميللي ثانية البقول الحالية من قوة عتبة 1.2X. L-نوع كا 2 + يتم قياس التيارات في وضع الجهد المشبك باستخدام المحتمل عقد -80 بالسيارات و100 ميللي ثانية منحدر النبض إلى -40 بالسيارات لإبطال نشاط نا سريع + المتداولة، يليه 100 ميللي ثانية نبض اختبار ل+10 بالسيارات عند 0.5 هرتز.

<ol>
	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein+&#946;3-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents.">G-Protein &#946;3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK,ACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IK,ACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation.">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-gated+potassium+current+IK,ACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation.">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li><li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes.">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li><li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes:+properties+and+consequences.">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK,ACh+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li><li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2++buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li><li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts:+review+of+the+literature+and+description+of+a+method.">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li><li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li><li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart.">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li><li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure.">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li><li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution.">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li><li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li><li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Enzyme Manual. , (1993).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-specific+effects+of+the+IKur/Ito/IK,ACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation.">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K++current+IK,ACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation:+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK,ACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials.">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li><li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes.">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li><li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance.">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

ورثينجتون بيوكيميائية كورب دعم هذا المنشور من خلال تغطية تكاليف الإنتاج من ملف الفيديو. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو إعداد المخطوطة.

هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان من الزوائد الأذيني حق الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح. من اجل استخدام هذه myocytes لقياس عصاري خلوي كا 2 + نحن تكييفها طريقة التي سبق وصفها 4-11 بحذف EGTA من حلول التخزين. بالفعل في عام 1970 لوحظ أنه على الرغم من myocytes فصل في وجود الكالسيوم 2 + أثناء عملية الهضم، كل منهم في انكماش وغير قابلة للحياة. 16،17 لذلك، يتم تنفيذ عزل خلية في كا 2 + خالية حل. ومع ذلك، فإن إعادة إدخال تركيزات الفسيولوجية للكا 2 + أسفرت السريع كا 2 + تدفق وموت الخلايا. وقد وصفت ذلك بأنه كا 2 + ظاهرة التناقض الذي لوحظ أصلا في قلوب perfused بواسطة زيمرمان وهولسمان 18 تعديلات من وسائل الإعلام بما في ذلك الحد من عزلة الرقم الهيدروجيني إلى 7.0، &lt;سوب&gt; 19 إضافة taurin 20 أو كميات صغيرة من الكالسيوم 2 + (راجع الخطوة 3.2 و 4.1)، 21 فضلا عن تخزين myocytes معزولة في EGTA تحتوي على تخزين حل 22 وقد اقترحت لمنع كا 2 + المفارقة 17 ومع ذلك، فمن المعروف جيدا أن كا 2 + التخزين المؤقت من خلال EGTA يقلل من السعة من نوع L-كا 2 + الحالية التي يسببها كا 2 + سعة عابرة والنتائج في الاضمحلال ثنائي الطور من كا 2 + العابرين. 23 ولذلك، فإننا حذفت EGTA في جميع مراحل عملية عزل كامل من أجل الحصول على كا 2 + العابرين مع الخصائص النموذجية، ويضمحل حيد الطور. لحماية الخلايا من كا 2 + المفارقة رفعنا النهائي كا 2 + تركيز المحلول التخزين بطريقة تدريجية حتى 0.2 ملم. اختيار كولاجيناز هو على الارجح الخطوة الأكثر أهمية لنجاح العزلة خلية عضلية. كول التقليديةagenases استعدادات الخام تم الحصول عليها من نسج كلوستريديوم وتحتوي على كولاجيناز بالإضافة إلى عدد من proteinases، polysaccharidases والليباز الأخرى. استنادا على collagenases تكوين عامة تنقسم إلى أنواع مختلفة. رثينجتون 24 أنواع كولاجيناز الأول والثاني استخدمت بنجاح لعزل myocytes الأذيني الإنسان. 4-10،15،25-30 في بروتوكول موضح لدينا في الوقت الحاضر نحن نوصي باستخدام كولاجيناز النوع الأول، على الرغم من أننا كنا أيضا قادرة على الحصول على كميات مقبولة من خلايا قابلة للحياة باستخدام كولاجيناز من النوع الثاني. ومع ذلك، وحتى داخل نوع واحد كولاجيناز هناك تباين كبير دفعة إلى دفعة فيما يتعلق بأنشطة الانزيم. تتطلب هذه الاختلافات حذرا اختيار دفعة واختبار مختلف دفعات لتحسين إجراء العزل. وتتوفر أداة دفعة الاختيار على الانترنت من رثينجتون بيوكيميائية شركة ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php) يمكن استخدامها للعثور على دفعات المتاحة مع التشكيل التي قد تظهر لتكون مناسبة للعزلة myocytes الأذيني الإنسان. حاليا نحن نستخدم كولاجيناز النوع الأول مع 250 U / ملغ كولاجيناز النشاط، 345 U / ملغ النشاط caseinase، 2.16 U / ملغ النشاط clostripain و 0.48 U / ملغ النشاط زيتية (الكثير # 49H11338). الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء الموضح في هذه المخطوطة يمكن أن تستخدم في غضون 8 الموارد البشرية لدراسات التصحيح، المشبك، كا 2 + قياسات عابرة ومزيج من الاثنين معا. 15 وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الخلايا القياسات من الانكماش الخلوية في استجابة لتحفيز الحقل الكهربائي أو التحفيز الكهربائي باستخدام ماصة التصحيح، المشبك (الملاحظات غير منشورة).

<html> دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف الخلوية كا 2 + تشوهات تتطلب معالجة العضلية معزولة. عادة ما يتم الحصول على هذه عقب التعرض في المختبر عينات من أنسجة القلب إلى الإنزيمات الهضمية (كولاجيناز، هيالورونيداز، ببتيداز الخ). منذ التقرير الأول للعزلة myocytes القلب قابلة للحياة في عام 1955 (2) وقد وضعت كمية كبيرة من البروتوكولات من أجل حصاد العضلية الأذيني البطيني واحد من الأنواع المختلفة بما في ذلك الماوس، الجرذان والأرانب والكلاب والخنازير الغينية والبشرية. في هذا الاستعراض ونحن نركز على عزلة myocytes الأذيني الإنسان. فيما يتعلق بإجراءات لعزل myocytes من الأنواع الأخرى التي تشير إلى &quot;ورثينجتون الأنسجة التفكك دليل&quot; التي تقدمها ورثينجتون بيوكيميائية كورب، الولايات المتحدة الأمريكية ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). = &quot;jove_content&quot;&gt; وتستمد الأذيني بروتوكولات العزلة خلية عضلية الإنسان عموما من الطريقة الموصوفة من قبل بوستامانتي، وآخرون. 3 هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من تقنية، والتي يتم تكييفها من أسلوب المنشورة سابقا، من أجل الحصول myocytes الأذيني مناسبة ليس فقط للتجارب التصحيح، المشبك ولكن أيضا لفي وقت واحد داخل الخلايا كا 2 + القياسات. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف القلب الخلوية كا 2 + التعامل مع التشوهات العضلية يتطلب معزولة. وبالإضافة إلى ذلك، إمكانية للتحقيق myocytes من المرضى الذين يستخدمون هذه التقنيات هو شرط لا تقدر بثمن لتوضيح الأساس الجزيئي لأمراض القلب مثل الرجفان الأذيني (AF). 1 هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان والتي هي مناسبة لكلا دراسات التصحيح، المشبك والقياسات في وقت واحد من تركيزات + داخل الخلايا كا 2. أولا، يتم المفروم الزوائد الأذيني الحق تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح إلى قطع الأنسجة الصغيرة (&quot;أسلوب قطعة&quot;) وغسلها في كا 2 + خالية حل. ثم يتم هضمها وقطع الأنسجة في كولاجيناز والبروتيني تحتوي على حلول مع 20 ميكرومتر كا 2 +. بعد ذلك، myocytes معزولة هي harveSTED عن طريق الترشيح والطرد المركزي لتعليق الأنسجة. وأخيرا، يتم ضبط كا 2 + التركيز في حل تخزين الخلايا متدرج إلى 0.2 ملم. نناقش بإيجاز معنى كا 2 + والكالسيوم 2 + التخزين المؤقت أثناء عملية العزل، وكذلك تقديم التسجيلات ممثل امكانات العمل والتيارات غشاء، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا 2 + قياسات عابرة، التي أجريت في هذه myocytes معزولة.

ويبين الشكل 2A ثلاثة أمثلة ممثل من myocytes الأذيني حق من حقوق الإنسان معزولة. لقياس العائد الخلية نحن ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية (الخطوة 5.5) على شريحة المجهر CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). غلة خلية بلغ متوسط ​​في الشكل 2B تشير بوضوح إلى أن هناك اتجاها لانخفاض العوائد في الخلية AF المزمن (الكاف) عينات المرضى (أنبوب A: 16.5 ± 3.1 cells/10 ميكرولتر (ن = 29) مقابل 5.1 ± 2.3 ميكرولتر cells/10 (ن = 10) في SR والكاف، على التوالي، P &lt;0.05؛ أنبوب B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ميكرولتر (ن = 29) مقابل 5.9 ± 2.0 cells/10 ميكرولتر (ن = 9) في ريال وCAF، على التوالي، P = 0.107). وترد أمثلة ممثل قياسات العمل ذات الإمكانات والتسجيلات في وقت واحد من عصاري خلوي كا 2 + العابرين في الشكل 3. في حوالي 90٪ من الخلايا التحقيق، روقال انه عمل لإمكانيات أثار كا 2 + الإفراج يسبب تقلصات خلية واضحة ومنتظمة. كما ذكرت سابقا، فإن غشاء المحتملة يستريح، وهو مؤشر مقبول لسلامة الخلية، وبلغ متوسط ​​حوالي -73.9 ± 2.7 بالسيارات (ن = 23/10 myocytes / المرضى) و-77.7 ± 1.8 بالسيارات (ن = 19/8 myocytes / المرضى ) في SR والكاف على التوالي (P&gt; 0.05) يظهر 15 الشكل 4 التسجيلات في وقت واحد ممثل الجهد بوابات L-نوع كا 2 + التيارات وعصاري خلوي كا 2 + العابرين. تطبيق غير انتقائية إيزوبرينالين ناهض β-المستقبلات (1 ميكرومتر) يزيد سعة من كلا أنا كا، L وعصاري خلوي كا 2 + العابرين، مما يوحي سليمة β الأدرينالية إشارة تتالي تنبيغ. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1. مخطط تدفق من myocytes فلوو-3:00 تحميل البروتوكول (راجع الخطوة 6،1-6،5). M / V والكتلة / الحجم. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> الشكل 2. A، معزولة myocytes الأذيني حق من حقوق الإنسان بعد ساعة واحدة في حلول التخزين. B، يعني ± SEM من العائد خلية تحسب في 10 ميكرولتر من الخلايا في حل التخزين (انظر الخطوة 5.5). ن يشير إلى عدد من الأعمال التحضيرية داخل كل مجموعة. * P &lt;0.05. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> الشكل (3). التسجيلات الممثل العمل لإمكانيات أثار كا 2 +-العابرين (CAT) في خلية عضلية الأذيني من إيقاع الجيوب الأنفية ومركز حقوق الإنساناونك مريض الرجفان الأذيني. الأعلى: المحقونة غشاء الحالية (I M) تستخدم لتحفيز (0.5 هرتز). أدناه: تسجيل في وقت واحد من غشاء المحتملة (V M)، واتفاقية مناهضة التعذيب أثار (القاع). (Replotted بإذن من فويت وآخرون. 2012) 15 <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> الشكل 4. تسجيلات ممثل (1 ميكرومتر) تأثير إيزوبرينالين على L-نوع كا 2 + الحالية، أثار كا 2 +-العابرين (CAT) في خلية عضلية الأذيني من إيقاع الجيوب الأنفية ومريض الرجفان الأذيني المزمن. الأعلى: الجهد المشبك بروتوكول (0.5 هرتز). أدناه: تسجيل في وقت واحد من مجموع غشاء الصافية الحالية (I M)، والتي تعكس في الغالب L-نوع كا 2 + القط الحالي (وسط) واثار (القاع). (Replotted بإذن من فويت،وآخرون 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="الجدول 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> الجدول I. حلول. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="الجدول 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> الجدول الثاني. معدات معينة. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="الجدول 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> الجدول الثالث. لتحميل المواد من myocytes مع فلوو-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="الجدول 4" fo:conteNT-العرض = &quot;2.5in&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; الجدول الرابع. حل نوم للالتصحيح، المشبك. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="الجدول 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> الجدول خامسا حل ماصة للالتصحيح، المشبك *.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

وصفنا عزلة myocytes الأذيني الإنسان والتي يمكن استخدامها لكا داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; القياسات في تركيبة مع دراسات التصحيح، المشبك الكهربية.

عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم<sup&gt; 2 +</sup&gt; العابرون والتيارات غشاء

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

المتزامن لرسم الخرائط وكوانتيتاتيون من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي البشري

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

إعداد واستخدام خلايا العضلات الملساء الإنسان معزولة حديثا لتوصيف 9-فينانترول الحساسة التيارات التيشن

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...