Name: isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

כמו כן, אנו מודים למנתחי הלב באוניברסיטת היידלברג למתן רקמת פרוזדורים אנושיים וקלאודיה Liebetrau, קטרין Kupser ורמונה נגל לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם. תודה מיוחדת גם לאנדי וו טראפורד להצעות המועילות שלו והייעוץ במהלך הקמת 2 + המדידות חולפות קליפורניה. המחברים מבקשים להביע את התודה העמוקה ביותר שלהם לחברי המחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה (ראש: העורבים אורסולה) מהאוניברסיטה טכנולוגית של דרזדן על ההזדמנות שהם הציעו לנו ללמוד טכניקות בסיסיות ומיומנויות בסלולריים electrophysiology ובידוד cardiomyocyte. המחקר של המחברים הוא נתמך על ידי קרן המחקר הגרמני (Do769/1-1-3), משרד הגרמני הפדרלי לחינוך ולמחקר באמצעות רשת כשירות פרפור פרוזדורים (01Gi0204) ומרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם, איחוד האירופי באמצעות האיחוד האירופירשת ropean למחקר Translational בפרפור פרוזדורים (EUTRAF, FP7-בריאות-2010, פרויקט שילוב בקנה מידה גדול, הצעת מס &#39;261,057) והברית אירופית בצפון אמריקה פרפור פרוזדורי המחקר (ENAFRA) מתן הגט Leducq (07CVD03). הסקירה סכמטית שמוצגת בקובץ הווידאו הופקה באמצעות אמנות רפואית Servier.

פרוטוקולי ניסוי צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית וכל החולים צריכים לתת הסכמה מדעת בכתב. המחקר שלנו אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במנהיים, אוניברסיטת היידלברג (# 2011-216N-MA) ובוצע בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומית ובינלאומיות לרווחת אדם. כל החולים נתנו הסכמה מדעת בכתב. 0. קבלת רקמות אנושי פרוזדורים במהלך הליכי cannulation שגרתי בחולים שעברו ניתוח לב פתוח להשתלת המעקפים cardiopulmonary, קצה תוספת פרוזדורי ימין בדרך כלל להסיר ויכול לשמש לבידוד של cardiomyocytes פרוזדורים. לאחר כריתת דגימת הרקמה מועברת מייד לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל עם סטרילי Ca 2 + ללא פתרון תחבורה המכיל 2,3-butanedione monoxime (טבלת I; BDM, מעכב התכווצות, מניעת ג myocyteontracture). עם זמני הובלה בין דקות 30 ו -45, שלא זיהו את יתרון ברור של קירור או חמצון ביחס לשניהם מספר והאיכות של cardiomyocytes פרוזדורים מבודד. בתחבורה בכלל למעבדה צריכה להיות מהיר ככל האפשר. עם זאת, אם לא ניתן להימנע מתחבורה זמן ארוכה יותר, תחבורה על 4 מעלות צלזיוס בפתרון חומץ עשויה להיות יתרון. 1. Prearrangements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את thermocirculator, אשר שולט על הטמפרטורה של כוס המעייל (לוח ב &#39;). ודא שהטמפרטורה בתוך הכוס שווה 37 ° C. לכסות את הכוס עם מכסה זכוכית כדי לשמור על טמפרטורה קבועה בתוך הכוס לאורך כל תהליך הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל אני collagenase ופרוטאז XXIV לשלוש כוסות זכוכית ולאחסן אותו בטמפרטורת חדר. האנזימים ידוללו רק לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות 20 מ&quot;ל של Ca 2 + פתרון חופשי בצלחת פטרי ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חנות 250 מ&quot;ל של Ca 2 + פתרון חופשי באמבט מים ב 37 ° C. </li></ol> 2. ניקוי של הרקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת הרקמה יחד עם פתרון התחבורה לתוך צלחת פטרי (~ קוטר 10 ס&quot;מ) ולהסיר רקמת שומן בערך באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימת הרקמה. בין 200 ל 600 מ&quot;ג משמש לבידוד בתא. הרקמה שנותרה ניתן להקפיא בחנקן נוזלי לצורך הניתוח מאוחר יותר ביוכימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה 20 מ&quot;ל Ca 2 + פתרון חופשי על 4 מעלות צלזיוס (ראה שלב 1.3) וקוצץ את דגימת הרקמה לחתיכות קטנות של כ 1 מ&quot;מ 3 בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להיות מוצאים להורג על 37 מעלות צלזיוס ותחת המתה בגז רציפה עם 100% O 2. קצה פיפטה ניתן להציב על צינור החמצן כדי למנוע בעבוע חזק וליצור זרימת אוויר רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את נתחי הרקמות יחד עם פתרון Ca 2 + ללא בלכוס ומערבבים בזהירות מעייל לכ -3 דקות עם בר בחישה מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכמה שניות. מסנן את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב &#39;). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הכוס עם Ca 2 + פתרון חופשי ולחזור על שלב הכביסה 2.4 ו -2.5 פעמיים. </li></ol> 3. עיכול אנזימתי ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את נתחי רקמות עם 20 מיליליטר אנזים הפתרון E1 (טבלת I) המכיל collagenase ופרוטאז ומערבבים היטב במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של 10 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 35 דקות מסננות את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב &#39;) באופן שרוב גושי הרקמה יישאר בכוס. תשואת יתרירד גשם גושי רקמה מהרשת לתוך הכוס. </li></ol> 4. עיכול אנזימתי שני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את נתחי רקמות שוב עם collagenase 20 מיליליטר אנזים פתרון E2 המכיל רק אני (טבלת I). הוסף 40 μl של 10 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון באופן מיידי כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שימוש במספרי העיכול השני לקצוץ נוסף קרישי רקמות מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות לקחת דגימה באמצעות פיפטה פסטר כדי לבדוק את הניתוק של תאים. חזור על כל 2-3 דקות עד שזה cardiomyocytes בצורת המוט, מפוספס יופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכ 20-30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח השני) לתוך 50 מ&quot;ל פלקון צינור (Tube). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את נתחי רקמות בכוס עם 20 מ&quot;ל StoraGE הפתרון (טבלת I) 10 ועוד יותר לנתק את התאים על ידי טחינה דקה מכאנית עדינה בעזרת פיפטה סרולוגיות 20 מ&quot;ל עם מתקן. נסו להימנע מהיווצרות בועה מאז בועות משפיעות לרעה על הישרדות תא ואיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, טבלה השנייה) לתוך 50 מ&quot;ל פלקון Tube (צינור B). </li></ol> 5. הכנה סופית והתאמה הסופית Ca 2 + ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הן פלקון צינורות A ו-B (ראה שלב 4.5 ו -4.7) בשעה 95 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant משני הצינורות בזהירות על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את שני כדורים בפתרון 1.5 מיליליטר אחסון (טבלת I) כל אחד (בטמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי פעמים μl 7.5 מ&quot;מ של פתרון 2 10 CaCl לכל פלקון ומערבבים בזהירות. דגירה של 10 דקות לאחר כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 15 μl של פתרון 10 מ&quot;מ CaCl 2 להשיג 2 + ריכוז Ca סופי של 0.2 מ&quot;מ. </li></ol> 6. טעינה של myocytes עם פלורסנט Ca 2 + מחוון Fluo-03:00 (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא (צינור ו / או צינור B) לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל (צינור Eppendorf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את הפעולות הבאות בחשבון של הרגישות לאור של ניאון Ca 2 + מחוון Fluo-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מיקרוגרם של נגזר הקרום החדיר acetoxymethyl אסתר של Fluo-3 (Fluo-3 בבוקר, טבלת III) ב44 μl של Pluronic פתרון מניות ה-F-127 (טבלת III) (20% w / v בDMSO נטול מים) כדי לקבל 1 מ&quot;מ Fluo-03:00 פתרון מניות, שניתן לאחסן ב -20 ° C למשך שבוע לכל היותר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של Fluo-03:00 מניות פתרון לצינור microcentrifuge המכיל 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא (ראה שלב 6.1) ולהתסיסבזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה התא למשך 10 דקות בקופסה אטומה אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות בכ -6,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מחדש להשעות את גלולה בפתרון אמבטיה 1.5 מ&quot;ל (לוח ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את ההשעיה התא לכ -30 דקות לדה esterification לפני תחילת עם ניסויים. </li></ol> 7. תיקון-מהדק וepifluorescent Ca 2 + מדידות בו זמנית מאז מדידות תיקון-הידוק לא הנושא המרכזי של סקירה זו, אנו מתייחסים לקורא מעוניין לפרסומים אחרים המספקים יותר בתיאור מעמיק של טכניקה זו. 11-14 למען השלמות אנו מספקים סיכום קצר של פרוטוקול למדידה פוטנציאל פעולה או L-type Ca 2 + שני זרמים, ביחד עם 2 הקלטות בו זמנית חולפות +-CA. במהלך ניסויי myocytes הם superfused על 37 מעלות צלזיוס עם האמבטיה solutiעל לוח (IV) באמצעות מערכת טפטוף מהירה (Octaflow IITM, ALA מכשירים מדעיים, ניו יורק). עבור ניסויי מתח מהדק, K + זרמים חסומים על ידי הוספת 4-aminopyridine (5 mmol / L) וBaCl 2 (0.1 mmol / L) לפתרון האמבטיה. microelectrodes זכוכית ורוסיליקט משמש וצריך להטות התנגדויות של 2-5 MΩ כאשר התמלא פיפטה פתרון (לוח ה). בנוסף לFluo-03:00 טעינה של myocytes (ראה שלב 6), Fluo-3 כלולים גם בפתרון פיפטה (לוח ה). הקרינה היא נרגשת ב488 ננומטר ואור נפלט (&lt;520 ננומטר) יומר ל[ Ca 2 +] אני מניח <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> כאשר k = ד ניתוק מתמיד של Fluo-3 (864 Nז), F = Fluo-3 הקרינה;. F max = Ca 2 + רווי הקרינה המתקבלת בסופו של כל ניסוי 12 שני אותות חשמליים וCa 2 + אותות epifluorescent נרשמים בו זמנית. פוטנציאל פעולה הוא גירוי ברמה של 0.5 הרץ במצב נוכחי מהדק באמצעות פולסים 1 msec הנוכחיים של כוח סף 1.2x. L-סוג Ca 2 + זרמים נמדדים במצב מתח מהדק באמצעות פוטנציאל החזקת -80 mV ורמפת דופק של 100 אלפית שנייה ל-40 mV להשבית Na המהיר + שוטף, ואחרי 100 אלפיות שנייה בדיקת דופק ל+10 mV ברמה של 0.5 הרץ.

<ol>
	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein+&#946;3-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents.">G-Protein &#946;3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK,ACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IK,ACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation.">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-gated+potassium+current+IK,ACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation.">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li><li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes.">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li><li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes:+properties+and+consequences.">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK,ACh+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li><li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2++buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li><li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts:+review+of+the+literature+and+description+of+a+method.">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li><li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li><li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart.">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li><li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure.">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li><li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution.">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li><li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li><li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Enzyme Manual. , (1993).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-specific+effects+of+the+IKur/Ito/IK,ACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation.">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K++current+IK,ACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation:+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK,ACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials.">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li><li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes.">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li><li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance.">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

וורטינגטון יוכימית קורפ נתמך פרסום זה על ידי כיסוי עלויות ייצור של קובץ וידאו. היו הממנים שום תפקיד בתכנון מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם מנספחי פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח. על מנת להשתמש בmyocytes אלה למדידות של cytosolic Ca 2 + מתאמנים שיטה שתוארה בעבר על ידי השמטת EGTA 4-11 מפתרון האחסון. כבר בשנת 1970 זה היה ציין כי למרות שmyocytes לנתק בנוכחות של Ca 2 + במהלך עיכול, כולם היו בהתכווצות ואינו בת קיימא. 16,17 לכן, בידוד תא מתבצע בCa 2 + ללא פתרון. עם זאת, מחדש המבוא של ריכוזים פיסיולוגיים של Ca 2 + הביא המהיר Ca 2 + זרם ומוות של תאים. זו תוארה כ2 + תופעת פרדוקס Ca אשר נצפתה במקור בלבבות perfused ידי צימרמן וHulsman. 18 שינויים של תקשורת הבידוד כולל הפחתה של ה-pH 7.0, &lt;sup&gt; 19 תוספת של 20 taurin או של כמויות קטנות של 2 + (ראה שלב 3.2 ו -4.1) Ca, 21 כמו גם אחסון של myocytes מבודד בEGTA המכיל אחסון פתרון 22 כבר הציע על מנת למנוע את Ca 2 + פרדוקס. 17 עם זאת, זה ידוע היטב כי Ca 2 + חציצה באמצעות EGTA מקטין את המשרעת של L-סוג Ca 2 +-Induced Ca 2 + נוכחי אמפליטודות ותוצאות בריקבון biphasic של Ca 2 + הארעיים חולפות. 23 לכן, אנו הושמטו EGTA לאורך כל תהליך הבידוד על מנת לקבל Ca 2 + ארעיים עם מאפיינים טיפוסיים והתפרקויות monophasic. כדי להגן על התאים מCa 2 + פרדוקס הגדלנו 2 + ריכוז Ca הסופי של פתרון האחסון באופן הדרגתי עד 0.2 מ&quot;מ. הבחירה של collagenase היא כנראה השלב הקריטי ביותר לבידוד myocyte מוצלח. קול קונבנציונליagenases הם הכנות גולמי המתקבלות מקלוסטרידיום histolyticum ומכיל collagenase בנוסף למספר proteinases, polysaccharidases וlipases האחרים. בהתבסס על collagenases ההרכב הכללי שלהם מחולקים לסוגים שונים. -24 סוגי collagenase ורטינגטון I ו-II היו בשימוש בהצלחה לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. 4-10,15,25-30 בפרוטוקול המתואר כיום אנו ממליצים על השימוש בcollagenase הקלד, למרות שהיינו גם יכול להשיג כמויות מקובלות של תאי קיימא באמצעות collagenase סוג II. עם זאת, אפילו בתוך סוג collagenase אחת יש וריאציה אצווה כדי אצווה משמעותית ביחס לפעילות האנזים. וריאציות אלו דורשות בחירה אצווה זהירה ובדיקה של קבוצות שונות כדי לייעל את הליך בידוד. הכלי אצווה בחירה זמינה באינטרנט ומורטינגטון קורפ (ביוכימית <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php) ניתן להשתמש כדי למצוא קבוצות זמינות עם הרכב שהוכח להיות מתאים לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. כיום אנחנו משתמשים בcollagenase הקלד עם פעילות 250 U / מ&quot;ג collagenase, פעילות 345 U / מ&quot;ג caseinase, פעילות 2.16 U / מ&quot;ג clostripain ופעילות 0.48 U / מ&quot;ג tryptic (הרבה 49H11338 #). את התאים המתקבלים באמצעות ההליך המתואר בכתב היד הזה יכולים לשמש בתוך 8 שעות ללימודי תיקון-קלאמפ, Ca 2 + מדידות חולפות, ושילוב של שניהם. 15 בנוסף, תאים אלה מאפשרים מדידות של התכווצות סלולרית בתגובה לגירוי שדה החשמלי או גירוי חשמלי באמצעות פיפטה את תיקון המהדק (תצפיות שלא פורסמו).

<html> לימוד מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק והחקירה של הסלולר Ca 2 + מומים טיפול דורשים cardiomyocytes מבודד. אלה הם בדרך כלל מתקבלים בעקבות החשיפה במבחנה של דגימות רקמת לב לאנזימי עיכול (collagenase, hyaluronidase, peptidase וכו &#39;). מאז הדו&quot;ח הראשון של בידוד של myocytes לב קיימא בשנת 1955 2 כמות גדולה של פרוטוקולים פותחה במטרה לקצור cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים בודדים ממינים שונים, כולל עכבר, חולדה, ארנב, כלב, חזיר ואדם. בסקירה זו אנו מתמקדים בבידוד של myocytes פרוזדורי אדם. בנוגע לנהלים לבידודה של myocytes ממינים אחרים שאנחנו מתייחסים לאוכלוסיית &quot;וורטינגטון רקמות דיסוציאציה המדריך&quot; המסופק על ידי וורטינגטון יוכימית קורפ, ארה&quot;ב <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">(www.tissuedissociation.com).</a> = &quot;Jove_content&quot;&gt; פרוטוקולי בידוד myocyte פרוזדורי אדם בדרך כלל נגזרים מהשיטה שתוארה על ידי בוסטמנטה, et al. 3 כאן אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של טכניקה, אשר מותאם משיטה שפורסמה בעבר, על מנת להשיג myocytes פרוזדורים מתאים לא רק לניסויי תיקון-מהדק אלא גם עבור Ca 2 + מדידות תאיות בו זמנית. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

המחקר של מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק וחקר הלב הסלולרי Ca 2 + מומים טיפול דורש cardiomyocytes מבודד. בנוסף, האפשרות לחקור myocytes מחולים תוך שימוש בטכניקות אלה היא דרישה לא יסולא בפז על מנת להבהיר את הבסיס המולקולרי של מחלות לב כגון פרפור פרוזדורים (AF). 1 כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם אשר מתאימות לשניהם מחקרי תיקון-מהדק ומדידות בו זמניות של 2 + ריכוזי Ca תאיים. ראשית, נספחים פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח מבותרים לחתיכות קטנות של רקמה (&quot;נתח שיטה&quot;) ורחצו בCa 2 + ללא פתרון. ואז את נתחי הרקמות מתעכלים בcollagenase ופרוטאז המכילים פתרונות עם 20 מיקרומטר Ca 2 +. לאחר מכן, myocytes המבודדים הוא הארוויsted על ידי סינון וצנטריפוגה של ההשעיה הרקמות. לבסוף, Ca 2 + הריכוז בפתרון אחסון התא מותאם לשלבי 0.2 מ&quot;מ. אנו דנים בקצרה את המשמעות של Ca 2 + וCa 2 + החציצה במהלך תהליך הבידוד וגם מספקים הקלטות מייצגות של פוטנציאל פעולה וזרמים בממברנה, שניהם בו זמנית יחד עם Ca 2 + ארעיות מדידות, שבוצע בmyocytes המבודדים אלה.

איור 2 א מציג שלוש דוגמאות מייצגות מmyocytes פרוזדורי זכויות אדם מבודד. כדי לכמת את תשואת התא אנו פיפטה μl 10 של השעיה תא (שלב 5.5) בשקופית מיקרוסקופ CellFinder <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">(http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html).</a> תשואות ממוצעות של תא באיור 2 עולה בבירור כי קיימת נטייה לתשואות נמוכות יותר בתא הכרוני AF (CAF) דגימות חולים (שפופרת A: 16.5 ± 3.1 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.1 ± 2.3 cells/10 μl (N = 10) בSR וקפה, בהתאמה, p &lt;0.05; צינור B: 17.9 ± 3.9 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.9 ± 2.0 cells/10 μl (n = 9) בSR וקפה, בהתאמה, p = 0.107). דוגמאות מייצגות של מדידות פעולה פוטנציאליות והקלטות בו זמניות של Ca 2 + ארעיים cytosolic ניתנות באיור 3. בכ -90% מהתאים שנחקרו, tהוא פעולה ופוטנציאל, מופעל Ca 2 + שחרור גורם להתכווצויות תא ברורות וקבועות. כפי שדווח בעבר, פוטנציאל הממברנה במנוחה, אשר מהווה אינדיקטור מקובל לשלמות תא, בממוצע כ -73.9 ± 2.7 mV (n = / חולים 23/10 myocytes) ו-77.7 / חולי ± 1.8 (n = 19/8 myocytes mV ) בSR וCAF בהתאמה (p &lt;0.05). 15 איור 4 מראה הקלטות בו זמנית יציגים של מתח מגודרת סוג L-Ca 2 + הזרמים וCytosolic Ca 2 + ארעיים. יישום של isoprenaline אגוניסט β-adrenoceptor לא סלקטיבי (1 מיקרומטר) מגדיל אמפליטודות של שניהם אני Ca, L ו cytosolic Ca 2 + ארעיים, המצביע על מפל הולכים אותות β-adrenergic ללא פגע. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> F1 igure. תרשים זרימה של myocytes Fluo-03:00 טעינת פרוטוקול (ראה שלב 6.1-6.5). M / V, מסה / נפח. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> איור 2. A, myocytes מבודד אדם נכון פרוזדורים לאחר שעה אחת בפתרון אחסון. B, ממוצע ± SEM של תשואת התא נספרת ב10 μl של תאים בפתרון אחסון (ראה שלב 5.5). N מתייחס למספר של הכנות בתוך כל קבוצה. * P &lt;0.05. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> הקלטות נציג איור 3. של פעולה ופוטנציאל אצבע קל על הדק Ca 2 + ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס וChrחולה פרפור פרוזדורי onic. למעלה: הזריק קרום נוכחי (אני מ &#39;) המשמש לגירוי (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של פוטנציאל הממברנה (V ז), וחתול מופעל (תחתון). (Replotted באישור וויגט et al. 2012) 15 <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> הקלטות נציג איור 4. של האפקט (1 מיקרומטר) isoprenaline על סוג L-Ca 2 + נוכחי אצבע קל על ההדק Ca 2 + ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס ומטופל פרפור פרוזדורים כרוני. למעלה: מתח מהדק פרוטוקול (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של קרום נטו נוכחי (אני מ &#39;), המשקף בעיקר סוג L-Ca 2 + חתול נוכחי (באמצע) והפעיל (תחתון). (Replotted באישור וויגט,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="טבלת 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> פתרונות I. טבלה. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="טבלה 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> טבלה השנייה. ציוד ספציפי. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="טבלה 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> לוח ג. חומרים לטעינה של myocytes עם Fluo-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="טבלה 4" fo:conteNT-width = &quot;2.5in&quot; עבור: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; לוח ד. פתרון אמבט לתיקון מהדק. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="טבלה 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> טבלת פתרון V. פיפטה לתיקון מהדק *.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מדידות בשילוב עם לימודי תיקון-מהדק אלקטרו.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

הכנה ושימוש בתאי השריר החלקים הרגילים של האדם הבודד לאפיון של 9-פניל-זרמים רגישים לקטיון

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...