Name: isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

I tillegg vil vi takke de kardiale kirurger ved Universitetet i Heidelberg for levering av menneskelig atrial vev og Claudia Liebetrau, Katrin Kupser og Ramona Nagel for deres utmerkede teknisk støtte. Spesiell takk også til Andy W. Trafford for hans nyttige forslag og råd i etableringsfasen av Ca 2 + forbigående målinger. Forfatterne ønsker å uttrykke sin dypeste takknemlighet til medlemmer av Institutt for farmakologi og toksikologi (hode: Ursula Ravens) av Dresden teknologiske universitet for muligheten de tilbød oss ​​å lære grunnleggende teknikker og ferdigheter i mobilnettet elektrofysiologi og cardiomyocyte isolasjon. Forfatternes forskning er støttet av den tyske Research Foundation (Do769/1-1-3), den tyske føderale Utdannings-og forskningsdepartementet gjennom atrieflimmer Competence Network (01Gi0204) og den tyske Senter for Cardiovascular Research, EU gjennom Europa, Nettverk for translasjonsforskning i atrieflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, i stor skala integrere prosjektet Proposal No 261 057) og den europeisk-nordamerikanske atrieflimmer Forskning Alliance (ENAFRA) tilskudd av Fondation Leducq (07CVD03). Skjematisk oversikt vist i videoen filen ble produsert ved hjelp av Servier medisinsk art.

Eksperimentelle protokoller må godkjennes av den lokale etiske komité og alle pasienter må gi skriftlig informert samtykke. Vår forskning ble godkjent av etisk komité for medisinsk fakultet Mannheim, Universitetet i Heidelberg (# 2011-216N-MA) og ble utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke. 0. Innhenting Menneskelig atrievev Under rutinemessig kanylering prosedyrene i pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi for hjerte-bypass grafting, er spissen av den høyre atriale vedheng fjernes vanligvis og kan brukes for isolering av atriale kardiomyocytter. Etter eksisjon vevsprøve overføres umiddelbart til en 50 ml Falcon rør med sterilt Ca 2 +-fri transport-oppløsning inneholdende 2,3-butandion monoxime (tabell I; BDM kontraktile hemmer, forhindrer myocyte contracture). Med transport ganger mellom 30 og 45 min, hadde vi ikke gjenkjenne en klar fordel av kjøling eller oksygentilførsel med hensyn til både antallet og kvaliteten på isolerte atrial cardiomyocytes. Generelt transport til laboratoriet bør være så rask som mulig. Imidlertid, hvis lengre transporttid ikke kan unngås, transport ved 4 ° C i oksygenert løsning kan være fordelaktig. En. Prearrangements <ol><li> Slå på thermocirculator, som styrer temperaturen av den mantlede begerglasset (tabell II). Sørge for at temperaturen inne i begeret er lik 37 ° C. Dekk til begerglasset med et glasslokk å opprettholde en konstant temperatur i begerglasset gjennom hele isolasjon prosessen. </li><li> Vei Collagenase jeg og Protease XXIV i tre glass kanner og lagre det ved romtemperatur. Enzymene vil fortynnes umiddelbart før bruk. </li><li> Lagre 20 ml av Ca 2 +-fri løsning i en petriskål ved 4 ° C. </li><li>Lagre 250 ml av Ca 2 +-fri løsning i et vannbad ved 37 ° C. </li></ol> 2. Rengjøring av vevet <ol><li> Overfør vevsprøve sammen med transport-løsning inn i en petriskål (~ 10 cm diameter) og fjerne fettvev grovt med saks. </li><li> Vei vevsprøve. Mellom 200 og 600 mg brukes for celle isolasjon. Den gjenværende vev kan bli frosset i flytende nitrogen for senere biokjemisk analyse. </li><li> Overfør vevsprøve til petriskålen inneholdende 20 ml Ca 2 +-fri oppløsning ved 4 ° C (se trinn 1.3) og hakk vevsprøve i små biter på omtrent 1 mm 3 i størrelse. </li><li> Følgende trinn skal utføres ved 37 ° C og under kontinuerlig gassing med 100% O 2. En pipette tips kan plasseres på oksygen tube for å unngå sterk boblende og generere kontinuerlig luftstrøm. </li><li> Overfør vevet biter sammen med Ca2 +-fri løsning itil den mantlede begerglass og rør forsiktig for omtrent 3 minutter med en magnetisk rørestav. </li><li> Stopp omrøring og la vev biter å slå seg ned i noen sekunder. Nøye press supernatanten gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, Tabell II). Returnere forankrede vev biter fra mesh i begeret med tang. </li><li> Refill begeret med Ca 2 + gratis løsning og gjenta vasketrinnet 2,4 og 2,5 to ganger. </li></ol> 3. Først enzymatisk fordøyelse <ol><li> Re-suspendere vev biter med 20 ml enzym løsning E1 (tabell I) inneholder kollagenase og protease og rør forsiktig i 10 min. </li><li> Tilsett 40 pl av 10 mM CaCl 2-løsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 uM Ca 2 +. </li><li> Etter 35 min belastning supernatanten forsiktig gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, Tabell II) på en slik måte at det meste av vev biter forbli i begerglasset. Returnere restenregnet vev biter fra maskeveggen i begerglasset. </li></ol> 4. Second enzymatisk fordøyelse <ol><li> Resuspender vev biter igjen med 20 ml enzym løsning E2 inneholder collagenase jeg bare (Tabell I). Tilsett 40 pl av 10 mM CaCl 2-løsning umiddelbart for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 uM Ca 2 +. </li><li> I løpet av andre fordøyelsen bruke saks til ytterligere hogge vev klumper innimellom. </li><li> Etter 5 min ta en prøve ved anvendelse av en Pasteur-pipette for å kontrollere dissosiasjon av cellene. Gjenta dette hver 2-3 min før stavformede, tverrstripet cardiomyocytes vises. </li><li> Stopp omrøring og la vev biter å slå seg ned i ca 20-30 sek. </li><li> Sil supernatanten forsiktig gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, Tabell II) i et 50 ml Falcon-rør (strømpe A). Returner de fastholdte vevet biter fra maskeveggen i begerglasset. </li><li> Re-suspendere vev biter i begeret med 20 ml storage-løsning (tabell I) 10 og ytterligere dissosiere cellene ved forsiktig mekanisk finfordeling ved hjelp av en 20 ml serologisk pipette med dispenseren. Prøv å unngå bobledannelse siden bobler er skadelig for celle overlevelse og kvalitet. </li><li> Sil supernatanten forsiktig gjennom en nylon mesh (200 mikrometer, tabell II) i et 50 ml Falcon rør (rør B). </li></ol> 5. Siste forberedelse og justering av Final Ca 2 + konsentrasjon <ol><li> Sentrifuger både Falcon rør A og B (se trinn 4,5 og 4,7) ved 95 x g i 10 min. </li><li> Fjern supernatanten fra begge rørene nøye ved aspirasjon. Sørg for ikke å forstyrre pelleten. Kast supernatanten. </li><li> Re-suspendere begge pellets i 1,5 ml lagringsløsning (tabell I) hver (romtemperatur). </li><li> Legg til to ganger 7,5 mL av 10 mM CaCl 2 løsning til hver Falcon og rør forsiktig. Inkuber i 10 min etter hvert trinn. </li><li>Tilsett 15 pl av 10 mM CaCl 2-løsning for å oppnå en endelig Ca 2 +-konsentrasjon på 0,2 mM. </li></ol> 6. Lasting av myocytes med fluoriserende Ca 2 +-indikator Fluo-3 AM (figur 1) <ol><li> Overfør 1,5 ml cellesuspensjon (rør A og / eller rør B) inn i et 2 ml mikrosentrifugerør (Eppendorf rør). </li><li> Følgende trinn skal utføres under vurdering av lysfølsomheten av fluorescerende Ca 2 + Indikator Fluo-3. </li><li> Oppløs 50 ug av membranen gjennomtrengelig acetoksymetyl esterderivat av Fluo-3 (Fluo-3 AM, tabell III) i 44 mL av Pluronic F-127 (tabell III) stamoppløsning (20% w / v i vannfri DMSO) for å komme en 1 mM Fluo-3 AM stamoppløsning, som kan lagres ved -20 ° C i maksimalt en uke. </li><li> Tilsett 15 pl av den Fluo-3 AM stamoppløsning til mikrosentrifugerør inneholdende 1,5 ml cellesuspensjon (se trinn 6.1) og agiterenøye. </li><li> Inkuber cellesuspensjon i 10 min i et optisk ugjennomsiktig boksen. </li><li> Kort sentrifuger ved ca 6000 rpm. </li><li> Kast supernatanten og resuspendere pelleten i 1,5 ml bad-oppløsning (tabell IV). </li><li> Forlate cellen suspensjon i ca 30 min for de-esterifisering før du begynner med eksperimenter. </li></ol> 7. Samtidige Patch-klemme og Epifluorescent Ca 2 + Målinger Siden patch-klemme målinger er ikke det store temaet for denne anmeldelsen, vi henviser den interesserte leseren til andre publikasjoner som gir en mer dyptgående beskrivelse av denne teknikken. 11-14 For helhetens skyld gir vi en kort oppsummering av en protokoll for å måle aksjonspotensialer eller L-type Ca 2 +-strømmer, både sammen med samtidige Ca 2 +-transient opptak. Under eksperimenter myocytes er superfuseres ved 37 ° C med badekar solutipå (tabell IV) med en rask perfusjon system (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). For spennings-klemme eksperimenter, er K +-strømmer blokkert ved tilsetning av 4-aminopyridin (5 mmol / liter) og bacl 2 (0,1 mmol / L) til badet løsning. Borsilikatglass microelectrodes brukes og burde ha slege motstand på 2-5 MΩ når de er fylt med pipette løsning (Tabell V). I tillegg til Fluo-3 AM lasting av myocytter (se punkt 6), er Fluo-3 også inkludert i pipette-løsning (tabell V). Fluorescens er spent på 488 nm og lyset (&lt;520 nm) omdannet til [Ca 2 +] i forutsatt <img alt="Ligning 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> hvor k = d dissosiasjonskonstanten Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescens;. F max = Ca 2 +-mettet fluorescens innhentet ved slutten av hvert forsøk 12 Både elektriske signaler og epifluorescent Ca 2 +-signaler registreres samtidig. Aksjonspotensialer blir stimulert ved 0,5 Hz i current-klemme modus ved hjelp av en msek gjeldende pulser av 1,2 x terskel styrke. L-type Ca2 +-strømmer er målt i spennings-klemme-modus ved hjelp av et holdepotensial på -80 mV, og en 100-msek rampe-puls til -40 mV for å inaktivere den raske Na +-strøm, etterfulgt av en 100-msek test-puls til 10 mV ved 0,5 Hz.

<ol>
	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein+&#946;3-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents.">G-Protein &#946;3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK,ACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IK,ACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation.">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-gated+potassium+current+IK,ACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation.">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li><li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes.">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li><li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes:+properties+and+consequences.">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK,ACh+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li><li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2++buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li><li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts:+review+of+the+literature+and+description+of+a+method.">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li><li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li><li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart.">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li><li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure.">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li><li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution.">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li><li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li><li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Enzyme Manual. , (1993).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-specific+effects+of+the+IKur/Ito/IK,ACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation.">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K++current+IK,ACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation:+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK,ACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials.">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li><li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes.">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li><li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance.">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

Worthington Biokjemisk Corp støttet denne publikasjonen ved å dekke produksjonskostnadene for videofil. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Her beskriver vi en metode for isolering av humane atriefrekvenser myocytes fra høyre auriklene innhentet fra pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi. For å kunne bruke disse myocytes for målinger av cytosolisk Ca 2 + vi tilpasset en tidligere beskrevet metode 4-11 ved å utelate EGTA fra lagringsløsning. Allerede i 1970 ble det observert at selv om myocytes dissosierer i nærvær av Ca 2 + i løpet av fordøyelsen, alle var in kontraktur og ikke-levedyktige. 16,17 er derfor isolert celle utført i Ca2 +-fri løsning. Imidlertid re-innføring av fysiologiske konsentrasjoner av Ca2 + resulterte i hurtig Ca 2 + tilstrømning og celledød. Dette har blitt beskrevet som den Ca 2 + paradoksale fenomen som opprinnelig ble observert i perfused hjerter av Zimmerman og Hulsman. 18. Modifikasjoner av isoleringsventilen medier, inkludert reduksjon av pH til 7,0, &lt;sup&gt; 19 tilsetning av TAURIN 20 eller av små mengder av Ca 2 + (se trinn 3.2 og 4.1), 21 så vel som lagring av isolerte myocytter i EGTA inneholdende lagring-løsning 22 har vært foreslått for å hindre at Ca 2 + paradoks. 17. Imidlertid er det vel kjent at Ca 2 + bufring gjennom EGTA reduserer amplituden av L-type Ca2 + strøm-indusert Ca2 + transient amplituder og resulterer i en bifasisk nedbrytning av Ca 2 + transienter. 23. Derfor utelates vi EGTA gjennom hele prosessen isolasjon for å oppnå Ca 2 + transienter med typiske egenskaper og monofasisk henfall. For å beskytte cellene fra Ca 2 + paradoks vi økt den siste Ca 2 + konsentrasjon av lagringsløsning økes trinnvis inntil 0,2 mm. Valget av collagenase er trolig den mest kritiske trinnet for vellykket myocyte isolasjon. Konvensjonell collagenases er råolje preparater hentet fra Clostridium histolyticum og inneholder kollagenase i tillegg til en rekke andre proteinaser, polysaccharidases og lipaser. Basert på deres generelle sammensetning collagenases er delt inn i ulike typer. 24. Worthington kollagenaseklassene type I og II har blitt brukt for isolering av humane atrie myocytes. 4-10,15,25-30 I vår dag beskrives protokollen vi anbefaler bruk av collagenase Type I, selv om vi var også i stand til å oppnå akseptable mengder av levedyktige celler ved hjelp av kollagenase type II. Men selv innenfor en eneste kollagenase typen er det en betydelig batch-til-batch variasjon angående enzymaktivitet. Disse variasjonene krever nøye batch valg og testing av ulike grupper for å optimalisere isolasjon prosedyre. Den elektroniske tilgjengelig batch-utvalget verktøyet fra Worthington Biokjemisk Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php) kan brukes for å finne ledige batcher med en sammensetning som har vist seg å være egnet for isolering av humane atrielle myocytter. Foreløpig bruker vi collagenase type I med 250 U / mg kollagenaseaktivitet, 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg clostripain aktivitet og 0,48 U / mg tryptic aktivitet (vare # 49H11338). Cellene oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i dette manuskriptet kan brukes innenfor 8 timers for patch-clamp studier, Ca 2 + transiente målinger og en kombinasjon av begge. 15. I tillegg er disse celler tillater målinger av cellulær sammentrekning som reaksjon på elektriske feltet stimulering eller elektrisk stimulering ved hjelp av patch-clamp pipette (upubliserte observasjoner).

Studerer elektrofysiologiske egenskapene til kardiale ionekanaler med patch-clamp teknikken og utforskningen av mobilnettet Ca 2 + håndtering unormalt krever isolerte cardiomyocytes. Disse er vanligvis oppnådd ved å følge den in vitro-eksponering av kardiale vevsprøver til fordøyelsesenzymer (kollagenase, hyaluronidase, peptidase etc.). Siden den første rapport av isolering av levedyktige hjertemuskelceller i 1955 2 en stor mengde protokoller er utviklet for å høste enkelt-atriale og ventrikulære kardiomyocytter fra forskjellige arter, inkludert mus, rotte, kanin, hund, marsvin og menneske. I denne gjennomgangen har vi fokus på isolering av humane atrie myocytes. Angående prosedyrer for isolering av myocytes fra andre arter vi refererer til &quot;Worthington Tissue Dissosiasjon guide&quot; levert av Worthington Biokjemisk Corp, USA ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3. Her har vi gi en trinn-for-trinn beskrivelse av en teknikk som er tilpasset fra en tidligere publisert metode, for å kunne skaffe atrielle myocytter egnet ikke bare for patch-clamp eksperimenter, men også for samtidig intracellulære Ca 2 + målinger. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

Studiet av elektrofysiologiske egenskaper av kardiale ionekanaler med patch-clamp teknikken og utforskningen av hjerte mobilnettet Ca 2 + håndterer avvik krever isolerte cardiomyocytes. I tillegg er det mulig å undersøke myocytter fra pasienter ved hjelp av disse teknikker en uvurderlig kravet til å belyse den molekylære basis av kardiale sykdommer som atrial fibrillering (AF). Ett Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering av humane atrielle myocytter som er egnet for både patch-clamp studier og samtidige målinger av intracellulær Ca 2 + konsentrasjoner. Først er riktige auriklene innhentet fra pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi hakket i små vev biter (&quot;blings metoden&quot;) og vasket i Ca 2 +-free løsning. Deretter vevet biter blir fordøyd i collagenase og protease inneholder løsninger med 20 mikrometer Ca 2 +. Deretter, de isolerte myocytes er harveSTED ved filtrering og sentrifugering av vev-suspensjon. Endelig er Ca 2 +-konsentrasjonen i cellen lagringsløsning justeres trinnvis til 0,2 mM. Vi kort diskutere betydningen av Ca 2 + og Ca 2 + bufring under isolasjon prosessen og også gi representative innspillinger av aksjonspotensialer og membran strømmer, både sammen med samtidig Ca 2 + forbigående målinger, utført i disse isolerte myocytes.

Figur 2A viser tre representative eksempler fra isolerte menneskerettighetsaktivister atrie myocytes. For å kvantifisere celle utbytte vi pipetteres 10 pl cellesuspensjon (trinn 5.5) på en CellFinder objektglass ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Gjennomsnittlig celleutbytte i figur 2B viser tydelig at det er en tendens til lavere celleutbytte i kronisk AF (CAF) pasientprøver (tube A: 16,5 ± 3,1 cells/10 mL (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 ul (n = 10) i SR og Caf, henholdsvis p &lt;0,05; tube B: 17,9 ± 3,9 cells/10 ul (n = 29) vs 5,9 ± 2,0 cells/10 ul (n = 9) i SR og Caf, henholdsvis, p = 0,107). Representative eksempler på action-potensial målinger og samtidige opptak av cytosoliske Ca 2 + transienter er gitt i figur 3.. I ca 90% av de undersøkte celler, than action-potensial-utløst Ca 2 + utgivelsen fører til klare og vanlig celle sammentrekninger. Som rapportert tidligere, i gjennomsnitt hvile membran potensial, som er en akseptert indikator for celle integritet, ca -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocytes / pasienter) og -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocytes / pasienter ) i SR og CAF henholdsvis (p&gt; 0,05). 15 Figur 4 viser representative samtidige opptak av spenning-gated L-type Ca 2 +-strømmer og cytosolic Ca 2 + transienter. Anvendelse av den ikke-selektive β-adrenoreseptoragonist isoprenalin (1 uM), øker amplituden på både I Ca, L og cytosoliske Ca 2 +-transienter, noe som tyder intakt β-adrenerg signaltransduksjon kaskaden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figur 1. Flow diagram av myocytes Fluo-3 AM lasting protokollen (se trinn 06.01 til 06.05). m / v, masse / volum. <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figur 2. A, Isolerte menneskerettighetsaktivister atriefrekvenser myocytes etter en time i lagringsløsning. B, Mean ± SEM av cellen avkastning regnet i 10 mL av celler i lagringsløsning (se trinn 5.5). n refererer til antallet av preparater innenfor hver gruppe. * P &lt;0,05. <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figur 3. Representative opptak av action-potensial-utløst Ca 2 +-transienter (katt) i en atrial myocyte fra en sinusrytme og en chronic atrieflimmer pasienten. Topp: Injisert membran (I M) som brukes for stimulering (0,5 Hz). Under: Samtidig opptak av membranpotensialet (V M), og utløste CAT (nederst). (Plottes på nytt med tillatelse fra Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Figur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figur 4. Representative innspillinger av isoprenalin (1 mikrometer) effekt på L-type Ca 2 + strøm-utløst Ca 2 +-transienter (katt) i en atrial myocyte fra en sinusrytme og en kronisk atrieflimmer pasienten. Topp: Spenning-klemme-protokollen (0,5 Hz). Under: Samtidig opptak av samlet netto membran (I M), hovedsakelig som følge av L-type Ca 2 + strøm (i midten) og utløste CAT (nederst). (Plottes på nytt med tillatelse fra Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabell 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabell I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabell 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabell II. Spesifikke utstyret. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabell 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabell III. Stoffer for lasting av myocytes med Fluo-3 AM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabell 4" fo:content-width = &quot;2.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabell IV. Badekar løsning for patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabell 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabell V. Pipette løsning for patch-clamp *.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Vi beskriver isolering av humane atrielle myocytter som kan brukes for intracellulær Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Målinger i kombinasjon med elektrofysiologiske patch-klemme studier.

Isolering av humant Atrial myocytes for samtidige målinger av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienter og Membran Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolasjon og Kv Channel Recordings i Murine Atrial og ventrikulær cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Micro respirasjonsmålinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Utvikling og karakterisering av<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvessel Nettverk og kvantitative målinger av endotel [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Og nitrogenoksid produksjon

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Metoder for isolering, kultur og Funksjonell karakterisering av sinusknute muskelceller fra voksne mus

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Samtidige kartlegging og kvantifisering av Ribonucleotides i menneskelig Mitokondrielt DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Samtidige målinger av intracellulær kalsium og membran potensialet i fersk isolert og intakt musen Cerebral endotelet

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Forberedelse og utnyttelse av nyisolert humantdetrusor glatte muskelceller for karakterisering av 9-fenantrolfølsomme kationstrømmer

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...