Name: live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

نشكر عايدة دي لا كروز لتطوير وتدريس البروتوكول الأصلي الذي يستند هذا الإصدار 10. ويدعم عمل في مختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة Buttitta منحة GM086517.

1. يطير تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصليب تطير من المورثات المرغوب في قنينات بلاستيكية ضيقة مع 10 مل الخميرة الغلوكوز متوسطة 3 أو غيرها من وسائل الاعلام الغنية بالبروتين من اختيارك. ووصف واسعة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أدوات ?...

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحليل دورة الخلية، حجم الخلية النسبي وعدد الخلايا في الأنسجة الحية النسبية ذبابة الفاكهة في مراحل النمو المختلفة. عندما يقترن هذا التحليل مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري أو النسب تتبع، ويمكن الحصول على معلومات مفصلة ?...

التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم لقياس بقاء الخلية، حجم الخلية النسبي، والمحتوى الحمض النووي والتعبير بروتين فلوري في السكان الخلية الحية. ونظرا لتكرار الحمض النووي النووية خلال S-المرحلة، معلومات عن محتوى الحمض النووي في السكان من الخلايا يمكن استخدامها لاستنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية 1-3. وقد أصبح هذا الأسلوب حجر الزاوية في تحليل دورة الخلية في نظم نموذج من الخميرة إلى الثدييات. أصبح ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن نظام نموذجا ممتازا لالوراثية في التحليلات المجراة من تنظيم دورة الخلية. الأدوات الجينية الواسعة المتاحة في الذباب تسمح للتلاعب الأنسجة أنيقة محددة زمنيا وينظم من المنظمين دورة الخلية في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفلورسنت نسب البروتين على أساس تتبع 4-6. وقد استخدم التدفق الخلوي لدراسة محتوى الحمض النووي في عدد من أنواع الخلايا ذبابة الفاكهة، بما في ذلك endoreplicating الخلايا والخلايا الإنقسامية مثقف 7،8. وقدم تقدما هاما للدراسات في دورة الخلية الحية من قبل دي لا كروز وادغار، مع وضع بروتوكول لتحليل تدفق cytometric من العيش مضاعفا ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي 9،10، وهو البروتوكول الذي تم استخدامها وتكييفها من قبل العديد من مختبرات. هذه التقنية، عندما يقترن الوراثية في الجسم الحي تتبع النسب عن طريق محرض التعبير بروتين فلوري ووضع العلامات المحددة الأنسجة، ويسمح احد للحصول على معلومات حول آثار التلاعب الجيني في العام الخلية مضاعفة الوقت، وحجم الخلية وتحديد التوقيت الدقيق لمراحل دورة الخلية في الجسم الحي 9 ، 11. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة حتى الآن على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام إلى وصمة عار وتحديد الحمض النووي في الخلايا الحية، والتي حدت مستخدمين تتدفق cytometers مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية قادرة على إثارة صبغ هويشت. وتوجد عموما هذه فقط في مطابقة (أي دينار بحريني FACS VANTAGE، BD FACSAria) أو مكلفة متعدد الألوان أنظمة الفوق (أي BD LSR)، والتي تتطلب عادة دعم المرافق المؤسسية الأساسية التدفق. قمنا بتعديل بروتوكول المستندة إلى هويشت لاستخدام صبغة DNA الخلية الحية الجديدة من إينفيتروجن، Vybrant DyeCycle البنفسجي. هذه الصبغة هي متوافقة مع البنفسجي 405 نانومتر ليزر، أكثر شيوعا في تحليل الفوق أصغر والمتاحة في الصغيرة محلل الفوق مكتفية ذاتيا، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتحليل دورة الخلية التي يمكن أن يقترن مع نوع من الخلايا، حجم الخلية، عدد الخلايا وتحليل النسب في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة خلال مراحل مختلفة من التطوير باستخدام DyeCycle البنفسج وأقلم. هذا البروتوكول يوسع عدد من cytometers مناسبة لمثل هذا التحليل مع الأنسجة ذبابة الفاكهة ويقدم أمثلة عن كيفية هذا النوع من تحليل دورة الخلية الحية يمكن تعديلها لأنواع الأنسجة الإضافية ومراحل النمو.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

وقد التدفق الخلوي تستخدم على نطاق واسع للحصول على معلومات حول محتوى الحمض النووي في عدد السكان من الخلايا، إلى استنتاج النسب المئوية النسبية في مختلف مراحل دورة الخلية. وقد تم تمديد هذه التقنية بنجاح إلى الأنسجة الإنقسامية من طراز كائن ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات الجينية من تنظيم دورة الخلية في الجسم الحي. عندما يقترن مع نوع من الخلايا المحددة التعبير بروتين فلوري والتلاعب الجيني، يمكن للمرء الحصول على معلومات مفصلة حول الآثار المترتبة على عدد الخلايا، حجم الخلية ودورة الخلية الإلغاء في الجسم الحي. ومع ذلك فقد اعتمدت هذه الطريقة الخلية الحية على استخدام الخلية نفاذية هويشت 33342 صبغ الحمض النووي الإقحام، مما يحد من المستخدمين إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. قمنا بتعديل هذا البروتوكول على استخدام الخلية الحية صبغ الحمض النووي أحدث وVybrant DyeCycle البنفسج، متوافقة مع البنفسج الليزر 405nm وأكثر شيوعا. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكفاءة تحليل دورة الخلية إلى جانب الخليةنوع، حجم الخلية النسبي والمعلومات عدد الخلايا، في مجموعة متنوعة من الأنسجة ذبابة الفاكهة. هذا البروتوكول تمتد دورة الخلية تقنية مفيدة لتحليل الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة إلى محلل الفوق الصغيرة، والصوتية أقلم التركيز عداد الكريات، والتي يمكن تشغيلها وصيانتها على نطاق و-LAB واحد.

ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة لعينة الجناح اليرقات، معربا عن GFP في النصف الخلفي من الأنسجة، وذلك باستخدام قالب GFP المقدمة. ويتم الحصول على نتائج مماثلة مع نوع الأنسجة نفسها، ونمط التعبير عن طلب تقديم العروض باستخدام طلب تقديم العروض قالب المقدمة (الشكل 3A).</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

بروتوكول للتحليل دورة الخلية الحية<em&gt; ذبابة الفاكهة</emيوصف&gt; الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات. هذا البروتوكول يوفر في الوقت نفسه المعلومات حول حجم الخلية النسبي، عدد الخلايا، والمحتوى الحمض النووي ونوع من الخلايا عن طريق تتبع نسب أو الأنسجة التعبير محددة من البروتينات الفلورية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;.

تحليل دورة الخلية الحية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات وVybrant DyeCycle البنفسج الحمض النووي وصمة عار

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

انخفاض الجاذبية المظاهرات الأجهزة البيئة في نموذج المنمنمة تدفق عداد الكريات ورفيق ميكروفلويديك تقنية خلط

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

مقايسة الامتصاص الكولسترول استخدام الخلايا الحية التصوير التحليل مع خلية المراقبة الصحية

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...