Name: live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

우리는 개발 버전이 10의 기반이되는 원래의 프로토콜을 가르치는 아이다 드 라 쿠 르스에 감사드립니다. Buttitta 연구소의 작품은 NIH 교부금 GM086517에 의해 지원됩니다.

1. 축산 비행 <ol><li> 크로스 10 ㎖ 효모 포도당 보통 3 또는 원하는 다른 단백질이 풍부한 미디어 좁은 플라스틱 병에서 원하는 유전자형의 파리. 생체 내 형광 단백질 발현과 추적 조직의 특정 표현과 혈통에 사용할 수있는 광범위한 초파리 유전자 변형 도구는 다른 4,5 자세히 설명되어 있습니다. 24 시간 자손 컬렉션 시리즈를 얻기 위해 매일 신선한 유리 병에...

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

여기에 설명 된 프로토콜은 세포주기, 상대 셀의 크기 및 상대 셀 수 다양한 발달 단계에서 라이브 초파리 조직에서 분석 할 수 있습니다. 이 분석은 세포 유형의 특정 형광 단백질의 발현 또는 추적 계보와 결합 될 때, 자세한 정보는 신중 세포주기 또는 성장 섭동에 대한 세포 반응에 대해 얻을 수 있습니다. 뇌 세포가 체포 90 % G1에 일반적으로있는 경우 원칙적으로 증거로, 우리는 (3...

유동 세포 계측법은 세포 생존, 상대 셀 크기, DNA의 콘텐츠 및 라이브 세포 인구의 형광 단백질 발현의 측정에 사용하실 수 있습니다. S 상, 세포의 인구의 DNA 함량에 대한 정보 중에 핵 DNA의 복제로 인해 다른 세포주기 단계 1-3에서 상대 비율을 추론 할 수 있습니다. 이 방법은 효모에서 포유 동물 모델 시스템에서 세포주기 분석의 초석이되고있다. 초파리 초파리 세포주기 조절의 생체 내 분석에서 유전을위한 훌륭한 모델 시스템이되었다. 파리에서 사용할 수있는 광범위한 유전 도구는 생체 내 형광 단백질 기반의 혈통에 4-6 추적과 함께 세포주기 규제의 우아한 조직의 특정한 시간적 규제 조작을 허용합니다. 유동 세포 계측법은 endorepl 포함, 초파리 세포 유형의 숫자에 DNA 함량을 연구하는 데 사용되었습니다세포 배양 유사 분열 세포에게 7,8 icating. 생체 세포주기 연구를위한 중요한 사전은 라이브 배체 초파리 상상의 디스크 9,10의 유세포 분석, 많은 실험실에서 사용 적응 된 프로토콜에 대한 프로토콜의 개발, 데 라 크루스와 에드가에 의해 만들어졌다. 유도 형광 단백질 발현과 조직의 특정 라벨을 통해 추적 생체 혈통의 유전자와 결합 된이 기술은 생체 내 9에 하나의 전체 세포의 배가 시간, 셀 크기에 유전자 조작 효과에 대한 정보를 얻기 위해 세포주기 단계의 정확한 타이밍을 확인할 수 있습니다 11. 그러나이 방법은 지금까지 사용자가 흥미로운 훽스트 염색 할 수있는 UV 레이저 cytometers를 흐름을 제한하고 있습니다 살아있는 세포에서 DNA를 염색하고 정량화하는 세포의 사용을 투과 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료에 의존하고있다. 이들은 일반적으로 단지 분류기 (예 : BD FACS Vanta를에서 발견된다GE, BD FACSAria) 또는 고가의 여러 가지 빛깔의 벤치 탑 시스템 (예 : BD LSR), 기관 흐름의 핵심 시설로 일반적으로 필요로하는 지원을 제공합니다. 우리는 Invitrogen의, Vybrant DyeCycle 바이올렛에서 새로운 라이브 세포 DNA의 염료를 사용하는 훽스트 기반의 프로토콜을 수정했습니다. 이 염료는 더 작은 벤치 탑 분석기의 일반 및 작은 독립적 인 벤치 탑 분석기, cytometer에 집중 조율 어쿠스틱에서 사용할 수있는 보라색 405 nm의 레이저와 호환됩니다. 여기에서 우리는 DyeCycle 바이올렛과 조율을 사용하여 개발의 다양한 단계에서 세포 유형, 셀 크기, 셀 번호와 초파리 조직의 다양한 혈통 분석을 결합 할 수있는 세포주기 분석을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 초파리 조직과 같은 분석에 적합 cytometers의 수를 확장하고 살아있는 세포주기 분석이 유형의 추가 조직 유형 및 발달 단계에 맞게 수정 될 수있는 방법의 예제를 제공합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

유동 세포 계측법은 널리 다른 세포주기 단계에서 상대적 비율을 추론하는 세포의 인구 DNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 사용되었습니다. 이 기술은 성공적으로 생체 내에서 세포주기 조절의 유전 연구의 모델 생물 초파리의 유사 분열 조직으로 확장되었습니다. 셀 타입 특정 형광 단백질 발현과 유전자 조작과 함께 사용할 경우, 하나의 세포 수, 세포의 크기와 생체 내에서 단계적으로 세포주기에 미치는 영향에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나이 살아있는 세포 방법은 UV 레이저가 장착 흐름 cytometers에 사용자를 제한, 세포 투과성 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료의 사용에 의존하고있다. 우리는보다 일반적인 보라색 405nm는 레이저와 호환되는 새로운 살아있는 세포 DNA 염료, Vybrant DyeCycle 바이올렛을 사용하려면이 프로토콜을 수정했습니다. 여기에 제시 프로토콜은 세포와 결합 효율적으로 세포주기 분석 할 수 있습니다초파리 조직의 다양한 유형, 상대 셀 크기와 세포 수 정보. 이 프로토콜은 단일 실험실 수준에서 실행 및 관리 할 수있는 작은 벤치 톱 분석기 라이브 초파리 조직에 대한 유용한 세포주기 분석 기술, 조율 어쿠스틱 초점 cytometer에를 확장합니다.

그림 2는 제공된 GFP 템플릿을 사용하여 조직의 후방 절반 GFP를 표현, 유충의 날개 샘플에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 유사한 결과는 같은 조직 유형 및 제공 RFP 템플릿 (그림 3A)를 사용하여 RFP에 대한 발현 패턴을 얻을 수 있습니다. 제공된 템플릿 및 전압 (표 2) 유충의 눈 (그림 3B), 머리와 날개뿐만 아니라, 번데기의 눈, 두뇌 (그림 3D)와 ?...

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Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

라이브의 세포주기 분석을위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에 사용&gt; 조직이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 동시에 혈통 추적 또는 형광 단백질의 조직 별 발현을 통해 상대 셀 크기에 대한 정보, 휴대폰 번호, DNA 함량과 세포 유형을 제공<em&gt; 생체 내</em&gt;.

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

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