Name: live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Vi takker Aida de la Cruz for å utvikle og undervise den opprinnelige protokollen som denne versjonen er basert ti. Arbeid i Buttitta Lab er støttet av NIH stipend GM086517.

En. Fly Husbandry <ol><li> Cross flyr av ønskede genotyper i trange plast ampuller med 10 ml gjær-Glucose Medium 3 eller andre protein-rik media av ditt valg. De omfattende Drosophila transgene verktøy tilgjengelig for vev spesifikke uttrykk og avstamning sporing med in vivo fluorescerende protein uttrykk er beskrevet i detalj andre steder 4,5. Overfør foreldre til ferske ampuller daglig for å få serie på 24 hr avkom samlinger, eller for mer presis iscenesettelse, samle e...

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

Protokollen er beskrevet her gir mulighet for analyse av cellesyklus, relativ celle størrelse og relativ celle nummer i levende Drosophila vev på ulike utviklingsstadier. Når denne analysen er kombinert med celle-type spesifikke fluorescerende protein uttrykk eller avstamning sporer kan detaljert informasjon fås om cellulære responser til diskret cellesyklus eller vekst forstyrrelsene. Som bevis på prinsippet forstyrret vi quiescence i pupal fly hjernen ved å uttrykke G1-S cellesyklus regulatorer i GFP m...

Strømningscytometri kan brukes til måling av cellenes levedyktighet, relativ cellestørrelse, DNA-innhold og fluorescerende protein ekspresjon i levende celle populasjoner. På grunn av replikasjon av kjerne-DNA i løpet av S-fase, vil informasjon om DNA-innhold i en populasjon av celler som kan brukes til å utlede relative prosenter i forskjellige celle faser 1-3. Denne metoden har blitt en hjørnestein i cellesyklus analyse i modellsystemer fra gjær til pattedyr. Bananflue Drosophila melanogaster har blitt et utmerket modellsystem for genetisk in vivo analyser av cellesyklusregulering. De omfattende genetiske verktøy tilgjengelig i fluer tillate elegant vevet spesifikke og timelig regulert manipulasjoner av cellesyklus regulatorer sammen med in vivo fluorescerende protein-baserte avstamning tracing 4-6. Strømningscytometri er blitt brukt til å studere DNA-innhold i et antall av Drosophila celletyper, inkludert endoreplicating celler og kulturperler mitotiske celler 7,8. Et viktig fremskritt for in vivo cellesyklus studiene ble gjort av de la Cruz og Edgar, med utviklingen av en protokoll for flowcytometrisk analyse av levende diploide Drosophila imaginal plater 9,10, en protokoll som har blitt brukt og tilpasset av mange laboratorier. Denne teknikken, når kombinert med genetisk in vivo avstamning sporing via induserbar fluorescerende protein uttrykk og vev spesifikk merking, gjør det mulig å få informasjon om genmanipulering Effekter på total celle dobling tid, celle størrelse og for å fastslå presis timing av cellesyklus faser in vivo 9 11.. Men denne fremgangsmåte har hittil vært avhengig av bruken av cellen gjennomtrengelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende fargestoff for å farge og kvantifisere DNA i levende celler, som har begrenset antall brukere som flowcytometere med en UV-laser i stand til å eksitere Hoechst fargestoff. Disse er vanligvis bare finnes i sorters (dvs. BD FACS Vantage, BD FACSAria) eller dyrt flerfarget stasjonære systemer (dvs. BD LSR), vanligvis krever støtte av institusjonelle flyt kjernefasiliteter. Vi har endret Hoechst-basert protokoll for å bruke en ny live-cell DNA fargestoff fra Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Dette fargestoffet er kompatibel med en fiolett 405 nm laser, mer vanlig i mindre stasjonære analysatorer og tilgjengelig i små selvstendige benchtop analysator, Attune Acoustic Fokusering cytometer. Her presenterer vi en detaljert protokoll for cellesyklus analyse som kan være kombinert med celletype, celle størrelse, mobilnummer og avstamning analyse i en rekke Drosophila vev i ulike stadier av utviklingen ved hjelp DyeCycle Violet og Attune. Denne protokollen utvider antallet cytometere egnet for slik analyse med Drosophila vev og gir eksempler på hvordan en slik levende celle syklus analyse kan modifiseres for ytterligere vevstyper og utviklingsstadier.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

Flowcytometri har vært mye brukt for å innhente informasjon om DNA-innhold i en populasjon av celler, til å slutte relative prosenter i ulike cellesyklus faser. Denne teknikken har blitt utvidet til de mitotiske vev i organismen modell Drosophila melanogaster for genetiske studier av regulering av cellecyklus in vivo. Når kombinert med celle-type spesifikke fluorescerende protein uttrykk og genetiske manipulasjoner, kan man få detaljert informasjon om effekter på celle nummer, celle størrelse og cellesyklus innfasing vivo. Men denne live-celle metoden har vært avhengig av bruken av cellen gjennomtrengelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende fargestoff, noe som begrenser brukere å flowcytometere utstyrt med en UV-laser. Vi har endret denne protokollen for å bruke en nyere live celle DNA fargestoff, Vybrant DyeCycle Violet, kompatibel med de mer vanlige fiolett 405nm laser. Protokollen presenteres her gir mulighet for effektiv cellesyklus analyse kombinert med celletype, relativ cellestørrelse og celle nummerinformasjon i en rekke Drosophila vev. Denne protokollen utvider nyttig cellesyklus analyse teknikk for live Drosophila vev til en liten bordmodell analysator, Attune Acoustic Fokusering cytometer, som kan kjøres og vedlikeholdes på en enkelt-lab skala.

Figur 2 viser representative resultater for en larve vinge prøve, uttrykker GFP i bakre halvdel av vev, ved hjelp av den medfølgende GFP mal. Lignende resultater oppnås med de samme vevstype og uttrykk mønster for RFP med den medfølgende RFP malen (figur 3A). Den medfølgende malene og spenninger (tabell 2) er egnet for analyse av larver øyne (Figur 3B), hjerner og vinger, samt pupal øyne, hjerne (figur 3D) og vinger. Histogrammer av relativ cell...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

En protokoll for cellesyklus analyse av levende<em&gt; Drosophila</em&gt; Vev ved hjelp av Attune Acoustic Fokusering cytometer er beskrevet. Denne protokollen gir samtidig informasjon om relativ celle størrelse, celle nummer, DNA innhold og celletype via avstamning tracing eller vev spesifikke uttrykk for fluorescerende proteiner<em&gt; In vivo</em&gt;.

Live-Cell Cycle Analysis of<em&gt; Drosophila</em&gt; Vev bruker Attune Acoustic Fokusering cytometer og Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Vurdering av GFP Expression og Livskraftig Bruke Tali Bilde-Based cytometeret

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode for Live Imaging av Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreseptorcellene

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologisk Analyse spermatogenese: Skarp og Faste Preparater av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Redusert-gravitasjon Miljø Hardware Demonstrasjoner av en prototyp miniatyrisert Flowcytometer og Companion mikrofluid Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL Kolesterol opptaksanalyse bruke levende celle Imaging analyse med cellen helseovervåking

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...